牙鲆血清免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析.pdfVIP

第 14卷第4期 中 国 水 产 科 学 V01．14 NO．4 2007年 7月 JournalofFisherySciencesofChina July 2007 牙鲆血清免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析 刘云 ，孙峰 ，一，姜国良 (1．中国海洋大学 海洋生命学院，山东 青岛 266003；2．大连 自然历史博物馆，辽宁 大连 116023) 摘要：运用 SephacrylS-200凝胶层析和HiTraprProteinASephamse亲和层析 2种方法对牙鲆 (Paralichthysolivaceus)血 清免疫球蛋白进行分离纯化 ，结果表明，牙鲆免疫球蛋白分布于33％--50％的硫酸铵饱和溶液中，其中45％的分离效果 最好。凝胶层析和亲和层析样品均出现2个蛋白峰，用还原SDS检测确定牙鲆免疫球蛋白存在于第2个蛋白峰 中。牙鲆免疫球蛋白重链分子量约为75．4kD，轻链分子量约为29．9kD和28．2kD，推测牙鲆血清免疫球蛋白的分子量 为836kD。制备了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体 ，免疫双扩散法检测多克隆抗体效价为 1：32，免疫斑点法检测多克 隆抗体效价至少为 1：1600。运用免疫印迹法 (Western—bloting)检测了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体的特异性，实验 证明该抗体与牙鲆全血清中免疫球蛋白重链、轻链反应均成阳性。[中国水产科学 ，2007，14(4)：547—553] 关键词：牙鲆；免疫球蛋 白；凝胶层析；亲和层析；免疫印迹 中图分类号：Q959．486 文献标识码：A 文章编号：1005 同其他脊椎动物一样，鱼类的免疫系统包括细 生和制约条件进行研究。制备出针对免疫球蛋白的 胞免疫和体液免疫。近年来对其研究表明，硬骨鱼 多克隆或单克隆抗体，作为研究工具 日益显现出其 抗体主要有 IgM[，随着研究的逐步深入，陆续发 重要作用，其关键技术就是分离纯化出尽可能多的 现了 IgD[一 、IgZ[5]和 IgT[。对硬骨鱼 IgM 的研 纯度较高的免疫球蛋白。本研究利用与其他研究者 究多以淡水鱼为主，如对斑鲴 (Ictaluruspuncta— 不同的分离方法，探索了提纯牙鲆免疫球蛋 白的技 tus)L7l、鳜(Sinipercachuatsi) 、鲤 (Cyprinus r— 术，测定了牙鲆免疫球蛋白的分子量，并制备了特异 pio)[9-加]、欧洲鳗 (Anguillaanguilla)[11]、草鱼 性较强的兔抗牙鲆 Ig的多克隆抗体，这些都为今后 (Ctenopharyngodonidellus)u 、黄颡鱼(Pseudoba— 的研究提供了技术手段。 grusfulvidraco)u3J以及胡鲇 (Clariasbatrachus 1 材料与方法 L．)uJ的研究发现，IgM通常是由2条重链(H链)和 2条轻链(L链)组成的1个单体，或单体间通过连接 1．1 材料 链 J‘‘”链连接成四聚体，分子量为600~900kD0而对 牙鲆体质量450～550g，购于青岛南山水产品 海水鱼的研究较晚，现 已有 Bernard等[15]对黑鲈 市场。新西兰大 白兔体质量2000 2500g，购于青 (Dicentrachuslabrax)，Bang等[J、曲凌云等[17]对 岛市实验动物中心，为标准的实验动物 (合格证： 牙鲆 (Paralichthysolivaceus)，鄢庆枇等 【18]对大黄 200002004)。HiTraprProteinASepharose亲和层 鱼(Pseudosclaenac )以及冯娟等L19]对4种海水 析预装柱和 SephacrylS一200均为 Ame 帅 产 鱼类的血清免疫球蛋 白分离纯化部分性质进行了探 品。 讨。 1．2 牙鲆血清 IgIⅥ的制备与纯化 由于牙鲆 (Paralichthysolivaceus)是中国北方 1．2．1 牙鲆血清制备 将牙鲆捞出放在干净的磁 海水养殖的重要