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前 言 本标准依据GB/T 1.1-200的起草规则编写。 本标准由黑龙江省提出。 本标准起草单位：黑龙江省农业科学院畜牧研究所。 本标准主要起草人：刘娣、、猪应激综合症的PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪PCR检测的。 本标准适用于猪的检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB /T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 术语定义 下列术语和定义适用于本标准。 polymerase chain reaction，聚合酶链式反应 deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸 deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核酸三磷酸 base pair，碱基对以提取的核酸，作为DNA模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与标准分子量标记比较，来确定扩增产物的大小。 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为。 10×PCR缓冲液2.5 mmol/L dNTP、上下游引物水。引物序列如下，F：5-TGACCCCTAGGTGCTGGAT-3R：5-GGAGGGTTCTAAGCTCTGGG-3。 电泳级。 DL 2000标准分子量标记物。 5.6 组织提取液：3 mol/L氯化钠，1 mol/L（H 8.0），20 mol/L EDTA（8.0），高压灭菌。0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青、40%（W/V）蔗糖水溶液。10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(pH 8.0)，1 mmol/L乙二胺四乙酸(pH 8.0)242 g 三羟甲基氨基甲烷溶于800 m水中，加入100 m的0.5 mol/L 乙二胺四乙酸(8.0)和57.1 m冰醋酸，定容至1000 m，高压灭菌，贮存于室温 操作步骤 取10 mg组织样，加入500 μ组织提取液和μL蛋白酶K，55 ℃，120 r的摇床上消化~10 h。消化结束后，加500 μL三羟甲基氨基甲烷饱和酚上下10 min。12000 r/min离心10 min，上层水相，弃下层加等体积酚氯仿异戊醇（2423:1），混合10 min12000 r/min离心10 min，上层水相，弃下层加等体积氯仿异戊醇（231），混合10 min12000 r/min离心10 min，上层水相，弃下层加2倍体积的无水冰乙醇（20 ℃），水平摇大约30次，出现白色絮状物（DNA）用枪头挑出白色絮状物加700 μL 70 %冰乙醇，8000 r离心5 min，倒掉乙醇，自然干燥加~50 μL的TE缓冲液溶解~5 h。-20 ℃保存备用。 注： 使用等效的DNA提取试剂盒提取DNA模板。 μL PCR反应体系的比例混合各组分：上、下游引物各1 μL（浓度为10 μM），Buffer（10×）2.5 μL，dNTP（10 mM/L）2 μL，rTaq酶 0.2 μL，去离子水17.3 μL，2000 r/min离心10 s后μL混合液，预留一支空白，设为阴性对照，其余的分别加入待检个体的DNA模板（浓度为50 ng/μL）。PCR扩增条件为95 ℃预变性5 min94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环72 ℃延伸10 min4 ℃保存。 取1 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，制胶。在电泳槽中加电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取μL PCR扩增产物和μL上样缓冲液混合，进行电泳。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3 V/cm ~ 5 V/cm，电泳时间为30 min ~ 35 min。将电泳好的凝胶放终浓度为 μg/mL的染色缓冲液中染色15 min ~ 20 min，在紫外线透射仪或凝胶成像系统上观察结果，并做好记录。μL PCR扩增产物，10 U HhaI内切酶，2.5 μL内切酶缓冲液，去离子水补至20 μL。PCR-RFLP反应条件：37 ℃，12 h。电泳检测：酶切结束后，1000 r/min离心10 s，4 %琼脂糖凝胶电泳检测，具体操作同7.3。 8 结果及判断 8.1 实验结果成立条件 阴性对照的PCR产物电泳后无条带，而检测个体的PCR产物电泳后出现一条186 bp的特异性条带。8.2 结果判断 在实验结果成立的前提下，如果样品PCR产物电泳后 在实验结果成立的前提下，如果样品PCR产物126 bp和60 bp在实验结果成立的前提下，如果样品PCR产物126 bp和60 bp DB××/T ××××—×××× 6 1 DB23××××× I 3 ICS 65.040.10 P 35 备案号： 黑龙江省地方