大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA的转化.docVIP

大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA的转化 目的基因和载体DNA在体外重组后，必须重新引入活细胞内才能进行增殖。外源DNA引入寄主细胞的过程一般称为转化。在正常生长条件下，大多数细菌并不发生转化作用。Mandel等人发现，细菌细胞经过氯化钙处理之后，可促进λ噬菌体的转染作用。Cohen等人后来证明，Ca2+同样可以介导质粒DNA对细菌细胞的转化。这是由于宿主菌经过CaCl2处理后，使宿主细胞诱导产生了一种短暂的“感受态”，在此期间它们能够摄取各种外源DNA。以后，建立了这一基本技术的很多改进方案，但所有这些方案都旨在最大限度地提高用质粒转化不同的细菌菌株的效率。按Nandel方案处理细菌，每微克超螺旋质粒DNA可得到105～106个转化菌落。若使用经过改进的大肠杆菌菌株，并且用DMSO，还原剂和氯化六氨合高钴处理细菌，转化效率可提高100～1000倍。这些试剂的作用机制尚不清楚。至于转化率的提高，则是经验性实验结果。在大多数情况下，用简单的CaCl2方法制备的感受态细胞可以满足需要，每微克超螺旋质粒DNA可以得到将近107个转化菌落。 一、用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞和质粒DNA的转化 (一)试剂和材料 LB肉汤 　胰蛋白胨　　　　　　10g/L 　酵母浸膏　　　　　　5g/L 　氯化钠　　　　　　　5g/L 　pH　　　　　　　　　7.5 平板培养基 　胰蛋白胨　　　　　　10g/L 　酵母浸膏　　　　　　5g/L 　氯化钠　　　　　　　5g/L 　琼脂　　　　　　　　15g/L 　pH　　　　　　　　　7.5 顶琼脂培养基 　胰蛋白胨　　　　　　10g/L 　酵母浸膏　　　　　　5g/L 　氯化钠　　　　　　　5g/L 　琼脂　　　　　　　　10g/L 　氯化钙溶液　　　　　80mmol/L (二)操作步骤 1.将受体菌种在平板培养基上划线，37℃过夜，进行活化。 2.挑选单菌落，接入5mlLB肉汤，37℃震荡过夜。 3.从上述培养产物中取0.5ml，转入50mlLB肉汤，37℃震荡培养2～4小时，到细菌密度大约为5×107/ml。为得到有效转化，活细胞数不应超过103细胞/ml，可每隔20～30分钟测量OD260值以监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，OD260值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长培养物在生长周期的不同时相的OD260值，并将各稀释度的培养物铺于无抗生素的LB琼脂平皿以计算每一时相的活细胞，从而使分光光度读数得到标化。 切记：下述所有步骤均需无菌操作。 4.在水浴将菌液冷却10分钟，然后于4℃下3，500r/min离心15分钟，倾去上清液。 5.用25ml预先冰冷的高压灭菌氯化钙溶液(80mmol/L)重新悬浮细胞。 6.将细胞悬浮液在冰浴中冷15分钟，再于4℃下3，500r/min离心10分钟，倾去上清液。 7.用3ml预先冰冷的高压灭菌氯化钙溶液(80mmol/L)分装在预先冰冷的高压灭菌Eppendorf离心管内，每管0.2ml，4℃放置12～24小时。 8.加入待转化的重组质粒DNA溶液，和0.2ml菌液混匀，在冰中放置30分钟。 实验中一定要包括下面的对照：①加入已知量标准超螺旋质粒DNA制品的感受态细胞;②完全不加质粒DNA的感受态细胞。 9.在冰浴中放置30分钟后，转入42℃水浴中预热1.5分钟。 10.加入1mlLB肉汤，于37℃复壮30分钟到1小时，不用震荡。这个步骤是为了使细胞复壮和抗性基因开始表达(用于四环素筛选一般需1小时)。 11.分别取0.1ml、0.2ml、0.3ml等合适的量，涂布在含抗生素的平板培养基上。涂布时可使用扩散棒，也可加入顶琼脂培养基在43℃左右保温，取合适量的转化细胞加入2～3ml顶琼脂培养基中，混匀后，迅速倒入固体平板培养基上，使之分布均匀。 12.将涂布好的平皿在室温放置20分钟到半小时，使菌液被固体培养吸收或顶琼脂凝固。 13.将平皿放于37℃培养箱中过夜，一般在12～14小时菌落即可出现。 氯化钙法是用质粒DNA转化细菌细胞，尤其是大肠杆菌细胞经常使用的方法。在转化时要注意以下问题：①低温对Ca2+介导DNA的转化是必须的，氯化钙处理时一定要在低温条件下进行;②用于转化的细菌细胞在对数生长期的转化能力最高，静止生长期以后，转化能力逐渐丧失。 二、制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞 在某些情况