生物质谱在糖蛋白结构分析中的应用_百替生物.pdfVIP

生物质谱在糖蛋白结构分析中的应用 项目完成人：桑志红 蔡 耘 项目完成单位：国家生物医学分析中心 随着人们对糖蛋白参与生命活动机理的日益深入了解，对天然糖蛋白及重组糖蛋白 类药物的分析越来越受到重视。重组糖蛋白类药物的质量控制更是直接关系到药物的疗 效及至人类的健康。九十年代以来，随着带有反射功能的基质辅助激光解吸附电离飞行 时间质谱（MALDI-TOF-MS）和纳升电喷雾串联质谱（nano-ESI-Q-TOF）等具有软电离 方式的现代质谱技术的发展，质谱以其高灵敏度和强有力的分析混合物的能力，提供了 生物大分子的分子量、序列、一级结构信息以及结构转换、修饰等方面的信息，使糖基 化分析有了重要的进展。 通常研究糖蛋白的方法是把蛋白链上的寡糖切下来，分别研究蛋白部分和寡糖部分 的结构，因此无法研究与两部分共同相关的结构问题，也不能区分不同糖基化位点上切 下来的寡糖。自90年代初，国外有人开始用质谱法研究糖蛋白的结构，同时描述了各个 位点的不均一性。我们用建立的现代生物质谱技术研究糖蛋白一级结构的方法，将其应 用与基因重组糖蛋白的结构分析。为糖蛋白结构分析及基因重组糖蛋白类药物的质量控 制提供新的手段。 一、 生物质谱研究糖蛋白结构方法的建立 实验所用仪器为：1.德国BRUKER 公司的REFLEXIII型基质辅助激光解吸附 电离飞行时间质谱仪，N 激光器，波长337nm，线性飞行距离150cm，加速电压2kv。2. 2 英国Micromass 公司Q-TOF型电喷雾串联质谱仪。源温80°C，气体流速40L/h，枪头电 -5 压650V，检测频率2.4S，氩气碰撞池压力6∗10 mbar。 1. 基质的选择，在MALDI-TOF-MS分析中，基质起着相当重要的作用。不同的基质对 不同类的物质响应不同，α-氰基-4-羟基肉桂酸用于测定糖蛋白核糖核酸酶 B效果相 对较好。 2. B 124 34 Asn 糖蛋白分子量的测定，糖蛋白核糖核酸酶 由 个氨基酸组成，在 位 处连 有一个高甘露糖型N-糖链。由于糖链的微不均一性，与普通蛋白质及核酸不同，其 分子离子峰在MALDI-TOF-MS 质谱图上表现为一簇峰，各峰之间约相差一个糖基。 正是由于这种微不均一性，使得其分子离子峰变宽，灵敏度降低。糖链分子量越大， service@100 service@100 wwwwww..110000bbiiootteecchh..ccoomm sseerrvviiccee@@110000bbiiootteecchh..ccoomm 峰越宽，灵敏度越低，所以一般只有糖链较短，蛋白的质量不太大的糖蛋白才能测定 其平均分子量。用 MALDI-TOF 可直接测定糖蛋白核糖核酸酶 B 的平均分子量为 15208.6Da。 核糖核酸酶B的MALDI-TOF-MS图 核糖核酸酶B的MALDI-TOF-MS图 核核糖糖核核酸酸酶酶BB的的MMAALLDDII--TTOOFF--MMSS图图 ++++ G（14879.5、15040.1、15203.0、15381.5、15539.1 Da） G（14879.5、15040.1、15203.0、15381.5、15539.1 Da） GG（（1144887799..55、、1155004400..11、、1155220033..00、、1155338811..55、、1155553399..11 DDaa））