1最终双缩脲测定奶粉中蛋白质中含量02.docVIP

双缩脲法测定奶粉中的蛋白质含量 【摘要】? 目的 尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法 使用，在50 nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比系，计算出样品中蛋白质的含量【关键词】? 奶粉；蛋白；【】蛋白质是人类最重要的营养物质之一。因此，蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。目前蛋白质定量方法较多, 如凯氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry 法等。虽然凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是通过测定氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰（如2008年9月“问题奶粉”的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）；Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时间长，灵敏度低，稳定性差等缺点［1］。为弥补这些不足，本实验利用酪蛋白中主要蛋白质是酪蛋白，每100克婴幼儿奶粉中含12克～25克。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯酪蛋白。 4实验设备 可见光分光光度计1台、离心机1台、电热器1台、电子天平（0.01 g）1台、pHS-3C酸度计1台、烧杯、试管15支、漏斗、移液管若干、胶头滴管2~3支、离心管等。 5实验材料和试剂 5.1材料与试剂 奶粉，双缩脲试剂，体积分数95%乙醇无水乙醚0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液缓冲溶液300ml（先配置A液和B液） A液（0.2mol/L醋酸钠溶液）：称NaAc·3H25.44g，定容200ml B液（0.2mol/L醋酸溶液）：称优级纯醋酸（含量大于99.8%）g，定容至00ml 取A液177Ml，B液123ml，混合既得PH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液300mlmg/mL牛血清白蛋白：配置20毫升。（每组用） 0.9%的生理盐水配置2000毫升。（全班用） 操作标准应用曲线的绘制 1.取15支试管，按下表编号、加试剂 管号 0 1 2 3 4 5 6 样品 牛血清白蛋白(mg)含量 0 0.6 1.2 2.4 3.6 4.8 6.0 ? 2mg/mL牛血清白蛋白体积(mL) 0 0.3 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 － 待测液体积(mL) － － － － － － － 3.0* 生理盐水(mL) 3.0 2.7 2.4 1.8 1.2 0.6 0 0 双缩脲试剂 3毫升混匀反应30分钟后 生理盐水定容至25毫升 OD540 ? ? ? ? ? ? ? ? 3. 以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。 4.以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线。 5.称取1克奶粉，生理盐水定容至10毫升即为样品液 :6.2奶粉中酪蛋白样品制备将100ml加热至40，在搅拌下慢慢预热至40、PH4.7的醋酸缓冲溶液，用精密PH试纸或酸度计调PH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15min(3000r/min)，弃去上清夜，得酪蛋白粗制品（或用细布过滤，收集沉淀） 用水洗沉淀3次，离心10min(3000r/min)，，弃去上清夜 在沉淀中加入30ml体积分数95%乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽虑，用乙醇-乙醚混合液（乙醇和乙醚按1：1等体积混合）200ml洗沉淀2次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品分析结果的表述与计算? 讨论 ??? 奶粉中蛋白质含量是奶粉检验工作的一项重要指标。目前国内主要采用常规凯氏定氮法， 国外也多采用常规或改良的凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量，但此法费时、费水、费电，操作繁琐， 试剂消耗量大，且不能有效区分非蛋白氮［2、3］。常见的含氮化合物如硝酸铵和尿素比牛奶蛋白质的含氮率都高，易溶于水，很容易掺入奶粉等食物中；而三聚氰胺虽然常温和冷水状况下在水中的溶解度非常低［4］，但是人们平时习惯上和奶粉说明书上都要求用温开水冲调，例如60时三聚氰胺在100 g水中可以溶解1.8 g，100时溶解6.4 g，因而掺伪问题容易受到人们的忽视。 国内已有多篇文献涉及有关乳制品中蛋白质含量测定方法的研究，例如，云南工业大学张惠芬等探讨了在奶粉、豆奶粉、鱼粉中人为掺入尿素、硫酸铵等含氮化合物对蛋白质测定的影响，结果表明：用95%乙醇能很好地将尿素与食品中蛋白进行分离，回收率较高，并能方便、快速测定掺入量。对掺入硫酸铵等无机铵盐的测定，采用加MgO调到弱碱性，直接蒸馏测定［5］。成都理工大学李海玲等通过对Lowry法、BCA法、磺基水杨酸沉淀法、Bradford法等4种常用蛋白浓度测定方法的研