大曲真核微生物群落PCR-DGGE电泳条件优化.pdfVIP

第24卷第5期 四川理工学院学报(自然科学版) Vo1．24 No．5 2011年 l0月 JournalofSichuanUniversityofScience＆Engineering(NaturalScienceEdition) 0ct．2011 文章编号：1673—1549(2011)05-0515-04 大 曲真核微生物群落 PCR—DGGE电泳条件优化 罗惠波，侯海波，黄治国，卫春会，叶光斌 (四JIIN工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 自贡 643000) 摘 要：试验将DGGE方法应用于大曲真核微生物的研究，并对其电泳条件进行优化；对大曲真核 微生物的18SrDNA优化出的DGGE 电泳条件为：胶浓度 8％，变性范围40％～70％，电压条件先采用 200V、4min，再采用 130V、14h，获得的DGGE图谱具有较好的分离效果。 关键词：大曲；真核微生物；PCR—DGGE 中图分类号 ：Q1452 文献标识码 ：A 白酒的生产是以窖池和酒醅为基础，环境微生物、 验室，一20℃保存，尽快提取大曲微生物基因组 DNA。 大曲微生物和窖泥微生物进行着复杂 的物质能量代 1．2 主要试剂和仪器 谢…。大曲富含丰富的微生物，这些微生物代谢可产生 E．Z．N．A．TMsoilDNAkit(美国Omega公司)；Taq 淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和酯化酶等 ，大曲真核微生物 DNApolymerase(大连宝生物工程有限公司)；去离子甲 对 白酒的产酒、生香和产酯等方面起着十分重要作用。 酰胺 (德 国AppliChem)。PCR仪 (美 国BIORAD公司 研究大曲微生物群落多样性 ，阐明微生物群落组成及其 Mycycle)；DGGE电泳仪 (美国BIORAD公司DCode)； 与生化指标的联系，综合、客观、动态地判断大曲质量的 凝胶成像系统 (美国SIM公司)。 优劣，才能建立大曲生产标准，使大曲生产科学化 。 1．3 引物设计 对于大曲微生物的研究以前主要采用常规的分离 本试验采用近年来较常采用的四对真核微生物引 培养方法，通过纯培养得到的大曲微生物主要有霉菌、 物(表 1)。 细菌、酵母菌和放线菌等 ，但是常规培养方法耗时长， 表 1 用于 18SrDNA扩增的引物 准确率低，且可培养的微生物仅 占其微生物总类的0． 引物 引物序列(5-3) 篓 1％～10％。随着分子生学的发展，基因指纹图谱技术 越来越多的应用于微生物群落结构的研究 中 。本试 验利用PCR—DGGE(Polymerasechainreaction—denatu— ringgradientgelelectrophoresis，聚合酶链式反应 一变性 梯度凝胶电泳)技术来研究大 曲真核微生物群落结构， 并对电泳条件进行优化，为大曲真核微生物群落的研究 提供方便、快捷、可靠的研究手段。 1 材料与方法 1．1 试验材料 中高温大曲样品采 自四川泸州老窖酒厂，高温大曲 注：在含GC夹引物的5端加了一个富含GC序列 (40bp)：CGC 样品采 自四川郎酒集团。无菌取样，迅速用冰盒送回实 CCGGGC CGCGCCCCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G 收稿 日期：2011-09-19 基金项 目：四川省科教厅应用基础项 目(07JY029-026；2008JY0091)；四川省教育厅重大培育项 目(07ZZO18)；四川理工学院引进人才项目(2OO7—18) 作者简介：罗惠波(1969．)，男，四川自贡人，教授，主要从事酒类发酵方面的研究，(E-mail)sgxlhb@yahoo．con．cn 万方数据 5l6 9)11理工学院学报 (自然科学版)