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．临床实验诊断研究·
黏质沙雷菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制研究
邵海枫蒯守刚 王卫萍 史利宁 范明 黄梅李晓军
50℃1 rain。
黏质沙雷菌是引起肠道外感染的重要病原菌，与许多院 min，65℃8rain，30个循环，65℃延伸16
内感染的暴发流行有关，可引起肺炎、败血症和术后感染 4．碳青霉烯酶基因PCR扩增与序列分析：煮沸法提取
等…。碳青霉烯类药物对产ESBL和AmpC酶革兰阴性杆
菌尤其是肠杆菌科细菌具有良好的抗菌活性，随着碳青霉烯 5种碳青霉烯类常见耐药基因，引物及扩增条件参考文献
类抗萧药物的大量使用甚至过度治疗，临床耐药菌株也已出 [3-7]，产物送上海英骏公司测序。
现H检出率逐年提高，给临床治疗和控制院内感染带来新的 5．接合试验：黏质沙雷菌和大肠埃希菌C600分别接种
4ml
挑战。产碳青霉烯酶是引起临床肠杆菌科细菌对碳青霉烯 MH肉汤，35℃180]欠／min水平振荡过夜培养，各取
类药物耐药的主要原因。本研究对从我院ICU收集的3株500山混合35℃过夜孵育，取混合培养液、供体菌和受体菌
碳青霉烯类抗菌药物耐药的黏质沙雷菌耐药机制进行分析 培养菌液(阴性对照)各20山分别接种MH筛选平板(含
研究。 0．5ms／L亚胺培南+256ms／L利福平)，35℃过夜培养后
一、材料与方法 挑取单个菌落，接合子经鉴定为大肠埃希菌。
1．菌株来源：2007年10月至2008年4月从医院ICU Maxi质粒提取试
6．质粒提取与质粒消除试验：Qiagen
不同患者分离的3株黏质沙雷菌(s1来自中段尿、s2和S3剂盒提取黏质沙雷菌及相应接合子和大肠埃希菌V517的
来自痰)。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷质粒，0．8％琼脂糖凝胶电泳2h，回收质粒，以大肠埃希菌
伯菌ATCC700603。接合试验受体菌：利福平耐药的大肠V517质粒为标准带电泳后计算相对分子量。以此质粒为模
埃希菌C600。 板，进行碳青霉烯酶基因扩增。质粒消除试验将野生株接种
2．试剂与仪器：Vitek细菌鉴定仪(法国BioMerieux公
4mi含1．O％SDSMH肉汤培养，如此转种多次，至KB法检
司)，PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)，等电点聚焦电泳仪
测亚胺培南表型转为敏感，并提取质粒确认质粒被消除。
(瑞典PharmaciaBiotech公司)，聚丙烯酰胺凝胶板(瑞典
Amersham Maxi质粒提取试剂盒 7．药物敏感试验：琼脂稀释法检测3株黏质沙雷菌、相
Biosciencs公司)，Qiagen
应接合子和质粒消除株对11种抗菌药物以及亚胺培南、美
(德国Qiagen公司)，质粒DNA凝胶回收试剂盒(上海申能
博彩公司)。 罗培南与克拉维酸组合的MIC。
3．染色体DNA同源性分析：煮沸法提取细菌DNA，用 8．B内酰胺酶IEF：冰浴超声破碎法提取耐药株及接合
ERIC．PCR引物口1扩增，琼脂糖凝胶电泳后对产物进行基因子B内酰胺酶，加入聚丙烯酰胺凝胶(pI3．5—9．5)进行
纽同源性分析。扩增条件：95℃预变性7min，95℃30s， IEF后，用含头孢硝噻吩(nit
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