FHIT基因5′CpG岛甲基化及其和结直肠癌的关系.docVIP

FHIT基因 5′CpG岛甲基化及其与结直肠癌的关系 作者:刘莲叶,段晓明,胡义奎 作者单位：1.南华大学，湖南 衡阳 421001；2.衡阳市中心医院，湖南 衡阳 421001； 3.南华大学肿瘤研究所，湖南 衡阳 421001 【摘要】 　　［目的］探讨结直肠癌FHIT基因甲基化及去甲基化试剂5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对HCT1116细胞生长的影响。［方法］ 用甲基化特异性PCR（MSP）检测4个结肠癌细胞株、30例结直肠癌患者的原发肿瘤组织及其对应的正常组织的FHIT基因甲基化状态，用流式细胞术、HE染色及免疫细胞化学检测5-Aza-CdR对HCT1116细胞生长的影响。［结果］ 4 个结肠癌细胞株中有3个细胞株(75%)存在FHIT基因5′CpG岛的甲基化，30例原发肿瘤组织有14例(46.7%)检出FHIT基因5′CpG岛的甲基化；用5-Aza-CdR处理 HCT1116细胞后，其凋亡率由用药前的1.49％增加到32.6％。［结论］ FHIT基因的5′CpG岛甲基化与结直肠癌的发生发展可能密切相关，5-Aza-CdR可能通过诱导细胞凋亡而抑制HCT1116细胞生长。 【关键词】 FHIT基因　甲基化　结直肠肿瘤　5-氮-2′-脱氧胞苷 　　结直肠癌的发生是一个多因素多步骤的过程。有研究表明结直肠癌组织中存在脆性组氨酸三联体（FHIT）基因蛋白质的表达缺失[1]，提示抑癌基因FHIT与结直肠癌的发生密切相关。且有作者认为位于FHIT基因5′启动子区域CpG岛的甲基化与FHIT基因的表达缺失有关[2~4]，提示FHIT基因5′CpG岛甲基化为该基因失活的机制之一。本文旨在研究FHIT基因甲基化与结直肠癌的关系，及应用去甲基化试剂5-氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxy cytine，5-Aza-CdR）处理结肠癌细胞HCT1116后，观察HCT1116细胞生长的变化，进一步明确FHIT基因5′CpG岛甲基化与结直肠癌的关系以及探索结直肠癌早期诊断、治疗的新思路。 1 材料与方法 1．1 材 料 1.1.1 主要试剂 RPMI1640培养基、小牛血清、临床样品基因组DNA小量抽提试剂盒（上海生工生物公司）、CpGnome DNA Modifiction Kit（chemicon）、TaKaRa TaqTM Hot Start Version(大连宝生物)、SssⅠ甲基化酶（New England BioLabs）、5-Aza-CdR（Sigma）、所有引物均由大连宝生物公司合成。免疫细胞化学S-P超敏试剂盒（福州迈新）。 1.1.2 肿瘤组织标本和细胞培养 组织标本来自南华大学附属第一医院及衡阳市中心医院2004年8月至2005年5月结直肠癌手术患者30例，年龄17 岁～73岁，其中男性21例，女性 9例；结肠癌患者14 例，直肠癌患者16 例；肿瘤分化程度：高分化11 例，中分化12 例，低分化7 例；病理分期（Dukes分期法）：A期8 例，B期9 例，C期10 例，D期 13例。 人结肠癌细胞株HT-29、SW480、HCT1116、HRT-18由南华大学肿瘤研究所惠赠。用含10％小牛血清RPMI1640培养基、37℃、5％CO2培养。 1.2 方 法 1.2.1 甲基化特异性PCR 用Herman等[5]描述的MSP来检测FHIT基因的甲基化状态。用亚硫酸氢盐修饰基因组DNA，使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而已经甲基化的胞嘧啶则不变。然后针对甲基化和非甲基化的等位基因分别设计其各自特异性的引物，用这两对引物对同一DNA模板分别进行PCR扩增来检测基因的甲基化及非甲基化状态。如果应用甲基化特异性引物使基因片段扩增，提示该基因片段发生了甲基化；若应用非甲基化特异性引物使基因片段扩增，则提示该基因片段无甲基化。如果两对引物都可以使DNA片段扩增，说明该基因片段有部分甲基化。 基因组DNA提取：收集组织及细胞应用临床样品基因组DNA小量抽提试剂盒（上海生工生物公司）提取基因组DNA，保存于－20℃备用。 基因组DNA亚硫酸氢盐修饰：取1Μg基因组DNA按照CpGnome DNA Modifiction Kit（chemicon）操作步骤进行，保存于－20℃备用。 PCR：FHIT基因引物序列参阅文献[6]（表1），扩增产物为74bp。反应总体积为50Μl，包括经亚硫酸氢盐修饰后的基因组DNA约50ng，1.2