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肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生物学活性测定 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要由单核-吞噬细胞产生的单核因子，不仅具有选择性地杀伤某些肿 瘤细胞，而且有多种免疫调节作用。其检测方法主要包括生物学活性测定和免疫学检测方法。其中细胞毒 生物学检测方法敏感性较高，最为常用；免疫学检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELI… 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要由单核-吞噬细胞产生的单核因子，不仅具有选择性 地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节作用。其检测方法主要包括生物学活性测定和免 疫学检测方法。其中细胞毒生物学检测方法敏感性较高，最为常用；免疫学检测方法包括酶 联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫测定法。 (一) 原理: TNF-α受体广泛地分布于多种肿瘤细胞和血细胞，根据TNF-α与相应靶细胞结合后引 起不同的生物学效应，建立了多种检测TNF-α生物学活性方法。某些肿瘤细胞膜表面的 TNF-α受体与TNF-α结合后，可导致这些肿瘤细胞的死亡，可通过检测对肿瘤细胞的杀伤 能力，来反映TNF-α 的生物学活性。若这种肿瘤细胞先用3H-TdR 标记，则被杀伤后３H-TdR 释放至细胞外，牽I 通过测定肿瘤细胞释放３H-TdR 的量来反映TNF-α 的杀伤活性。 (二) 操作步骤: 0.25 ％胰蛋白酶消化处于对数生长期的L929 细胞 ↓ 用RPMI1640 洗涤细胞后，调整细胞浓度至2× 10 ６／ml ↓ 加入３H-TdR ，20μci／ml ↓ 置37℃，5％ 培养箱中2～3h，摇动1 次／30min ↓ 用RPMI1640 洗涤2 次，800rpm× 5min ／次 ↓ 调整细胞浓度至2～3× 10 ５／ml 后，加入96 孔 培养板中，100μl／孔 ↓ 加入不同稀释度的待测样本(设三个重复孔) ↓ 加入放线菌素D，使放线菌素D 最终浓度至1μg／ml 用时设放线菌素、完全培基阴性对照和rTNF-α标准 品阳性对照 ↓37℃, 5 ％ 培养中24h 加入3 ％胰蛋白酶和0.25 ％DNA 酶各10μl／孔 ↓37℃，30min 用DYQ- Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于 9999型玻璃纤维滤纸上 ↓ 烤干后，进行β计数 结果判定: 1. TNF-α作用24h 后，在倒置显微镜下判定50％L929 细胞杀伤的稀释度即为１个 TNF-α活性单位。 2. 根据测得的cpm 值按下列公式计数活性单位: TNF-α活性单位(U ／ml) 放线菌素D 对照组cpm-实验组cpm ＝──────────────× 标准品活性单位× 待测样品稀释倍数 放线菌素D 对照组cpm-标准品cpm (三) 试剂和器材: 1. 鼠成纤维细胞(L929) 2. rTNF-α和待测样品 3. 放线菌素、D