PCR原理和操作--王.ppt

* 6、标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液 10μl4种dNTP混合物 各200μmol/L引物 10～100pmol模板DNA 0.1～2μgTaq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100μl * 7、PCR产物的检测 将反应产物取3-8μl作2.0％琼脂糖凝胶电泳，定性检测目的基因的扩增水平。 * 四、PCR反应特点： 特异性强：遵循碱基配对原则，忠实的复制模板链； 灵敏度高：指数方式增加的，能将pg (10-12 ) 量级的起始待测模板扩增到ug (10-6)水平，可从 100 万个细胞中检出一个靶细胞； 简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2-4h完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广； 对标本的纯度要求低：不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板； 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 * 五、PCR技术的局限性 为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。 聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。 PCR技术扩增产物的长度有限。 * 六、PCR技术的注意事项 防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并经常更换，永远在最后一步才加核酸，液体分装使用等。 引物设计合理。 Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环。 镁离子浓度对反应效率的影响。 仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等。 * * * 电泳技术 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。1809年俄国物理学家Peнce首先发现了电泳现象，但直到1937 年瑞典学者 A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪 ，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。 * 本世纪60-70年代，当滤纸、聚丙烯酰胺凝胶等介质相继引入电泳以来，电泳技术得以迅速发展。丰富多彩的电泳形式使其应用十分广泛。电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶，甚至病毒与细胞的研究。由于某些电泳法设备简单，操作方便，具有高分辨率及选择性特点，已成为医学检验中常用的技术。 * 电泳的基本原理 　　生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子。常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用.在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。 * 聚 合 酶 链 式 反 应 Polymerase Chain Reaction PCR 博士生导师：王斌 2012.10.29 病原生物学 * 生命现象是自然界最复杂的现象 What is life? The feature of the life The life on the Earth 科学认识生命 * 现代生命科学研究的里程碑之一 1839年 细胞学说 19世纪30年代，德国植物学家 施莱登（Matthias Jacob Schleiden，1804-1881）首先指出，所有植物体都是由细胞构成的。他的这个观点被德国动物学家施旺（Theodor Schwann，1810-1882）在动物组织和细胞研究中证实，所有动物也是由细胞构成的。施旺指出：“细胞是有机体，整个动物或植物体乃是细胞的集合体。它们依照一定的规律排列在动物体内。”在此基础上他们创立了细胞学说。 　 * 细胞学说将植物学和动物学联系在一起，论证了整个生物界在结构上的统一性，以及在进化上的共同起源，有力地推动了生物学向微观领域的发展。 尽管细胞学说的某些部分已成为历史的陈迹，然而其中心思想仍广泛而深刻地影响了后来生物学的发展，任何生物学的重要问题都必须从细胞中寻求最后的解答. * 现代生命科学研究的里程碑之二 1859年 Darwin进化论：达尔文（Charles Darwin，1809-1882）发表《物种起源》指出生物变异的普遍性、变异与遗传的关系， 提出了生存竞争和自然选择学说，系统地论述了物种形成的机制。 生物变异的普遍性、变异与遗传的关系，提出了生存竞争和自然选择学说，系统地论述了物种形成的机制。 * 达尔文在1859年出版的《物种起源》一书中系