JNK在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达的研究.pdfVIP

JNK 在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表 达研究 兰灵，王美美 东南大学附属中大医院风湿免疫科，江苏南京 (210009) 摘 要：目的：观察 c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)在慢性移植物抗宿主 病狼疮样小鼠肾组织中的表达情况，初步探讨其在狼疮肾炎肾脏纤维化中所起的作用。方法： 建立cGVHD 狼疮样小鼠模型。按照随机、对照原则将小鼠分为 12 周正常对照组（A 组）、 16 周正常对照组（B 组）、12 周模型组（C 组）及 16 周模型组（D 组）四组，每组6 只， 于12 周末处死A 组、C 组小鼠，16 周末处死B 组、D 组小鼠，采用双缩脲比色法观察各组 小鼠24 小时尿蛋白排泄量，HE 染色和Masson 染色观察肾间质纤维化程度，免疫组织化学 法定位检测JNK 、p-JNK 在肾组织的表达，RT-PCR 法检测各组JNK mRNA 表达及Western blotting 技术半定量检测JNK 、p-JNK 蛋白表达水平。结果： 12 周模型组小鼠24 小时尿蛋 白排泄量、JNK 、p-JNK 蛋白及mRNA 的表达与正常对照组相比均明显增加（p0.01 ），16 周模型组更甚（p0.01 ）。结论：JNK 、p-JNK 蛋白及mRNA 在cGVHD 狼疮样小鼠肾组织 中表达明显上调，其可能在狼疮肾炎肾纤维化进程中起着重要的作用。 关键词：慢性移植物抗宿主病；狼疮肾炎；JNK；肾纤维化；小鼠 狼疮肾炎 （lupus nephritis，LN ）是系统性红斑狼疮 （systemic lupus erythematosus，SLE） 患者最常见和最严重的并发症之一，也是 SLE 患者的主要死亡原因之一，其病变以肾小球、 血管、肾小管及其间质损害为特征，最终进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭。肾脏纤维化是 各型狼疮肾炎进展到终末期的共同病理表现，其主要的发生机制与肾小管上皮细胞转 分化(transdifferentiation，EMT) 、细胞外基质（ECM ）沉积以及细胞内多种促纤维化信号途 径被激活等有关。近几年来许多研究结果表明 JNK 信号传导通路的功能异常在肾脏纤维化 的发生、发展中起着重要作用[1]，但在LN 研究尚无报道，因此本文通过构建慢性移植物抗 宿主病(chronic graft versus host disease, cGVHD)狼疮样小鼠模型，探讨 JNK 在 LN 发展过程 中的表达与活化及其所起的作用。 1. 材料与方法 1.1 实验动物 8～10 周龄雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1 杂交鼠 ( 以下称F1 代小鼠)及 6～7 周龄 DBA/2 小 鼠购自中山大学医学动物中心，体重(20.17±1.20)g，SPF 级，饲养于本校公共卫生学院 SPF 级动物房。 1.2 模型的建立与分组 按照随机、对照原则将小鼠分为 12 周正常对照组（A 组）、16 周正常对照组（B 组）、 12 周模型组（C 组）及 16 周模型组（D 组）四组，每组 6 只。制作 cGVHD 狼疮样小鼠模 型。取 DBA/2 小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞，制成比例为约 60%脾细胞、30%胸腺细胞及 10%淋巴结细胞的单细胞悬液（用台盼蓝染色和细胞计数板计数，保证活细胞数大于 95% ）， 分别于第 0、3、7、10 d 经尾静脉注射于模型组 F1 代小鼠,每次给予细胞数约为 50×106 个。 正常对照组则于相同时间经尾静脉注射等体积生理盐水。四组小鼠首次尾静脉注射后每两周 留取一次24 小时尿，建模后第 12 周末处死 A 、C 两组小鼠，16 周末处死 B 、D 两组小鼠， 并取下肾脏，一部分置于-70℃低温保存以备提取总 RNA 和蛋白质，另一部分置于 10%中性 - 1 - 福尔马林溶液中，经石蜡包埋后切片行免疫组织化学实验和组织病理检查。 1.324 h 尿蛋白量测定 用双缩脲比色法测定 24 小时尿蛋白，小鼠尿液 1 ∶5 稀释后按