C2-2分子克隆工具酶.pdfVIP

2.2.2 反转录酶(reverse transcriptase) 2.2.2 反转录酶(reverse transcriptase) • 依赖于RNA 的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase) 。 • 依赖于RNA 的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase) 。 • 一般具有5’→3’DNA聚合活性以及很强的RNase H活性。 • 一般具有5’→3’DNA聚合活性以及很强的RNase H活性。 • 该酶无3’→5’外切酶校正作用，故存在错误碱基掺入;需高浓度 • 该酶无3’→5’外切酶校正作用，故存在错误碱基掺入;需高浓度 dNTP dNTP • 可以合成第一链cDNA ，也可以自身序列为引物继续合成第二 • 可以合成第一链cDNA ，也可以自身序列为引物继续合成第二 链cDNA （效率低）。 链cDNA （效率低）。 • RNase H具有核酸外切酶活性，能按5’→3’和3’→5’方向特异地 • RNase H具有核酸外切酶活性，能按5’→3’和3’→5’方向特异地 降解RNA:DNA杂交分子中的RNA链，使其成为长4~20个碱基 降解RNA:DNA杂交分子中的RNA链，使其成为长4~20个碱基 的寡核甘酸。 的寡核甘酸。 • 一般有两种：禽成髓细胞瘤病毒AMV (avian • 一般有两种：禽成髓细胞瘤病毒AMV (avian myeloblastosis virus) 反转录酶以及M-MLV （Moloney 鼠 myeloblastosis virus) 反转录酶以及M-MLV （Moloney 鼠 白血病病毒）反转录酶。 白血病病毒）反转录酶。 • AMV与M-MLV 的主要区别： • AMV与M-MLV 的主要区别： M-MLV 的RNase H活性较弱，有利于合成较长的cDNA 。 M-MLV 的RNase H活性较弱，有利于合成较长的cDNA 。 AMV 的反应温度较高（可达55℃），可用于基因比较复杂、 AMV 的反应温度较高（可达55℃），可用于基因比较复杂、 有二级结构或GC含量较高的RT反应。 有二级结构或GC含量较高的RT反应。 • 用途：以单链RNA为模板，以olig(dT) 、随机寡聚核 • 用途：以单链RNA为模板，以olig(dT)15~20 、随机寡聚核 15~20 苷酸（6~10 个）或基因特异引物合成cDNA ，可用于 苷酸（6~10 个）或基因特异引物合成cDNA ，可用于 cDNA文库构建、探针标记或RT-PCR反应。 cDNA文库构建、探针标记或RT-PCR反应。 2.2.3 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 教材p33 • 以DNA为模板合成mRNA，不需引物，但必须 有启动子。 • 常用的RNA聚合酶来源与SP3、T3和T7噬菌体。 • 用途：体外转录用于体外翻译的底物或体外剪 体外转录用于体外翻译的底物或体外剪 接反应的底物；用作RNA探针。 接反应的底物； 2.2.4 末端转移酶(terminal transferase) • 特性：不依赖于模板的DNA聚合酶；可在单链或双链 DNA （至少3个碱基）的3’-OH端（5’突出或平末端效 率低）添加一个或多个核苷酸。 教材p33 表2-6 同聚尾的