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细胞培养技术 Tissue culture 细胞培养 cell culture 是从体内取出组织的单个细胞或单一细胞群模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并保持细胞特性，为细胞培养。 各种液体要专人配制，并保证做到按规程行事；制备浓度精确、灭菌可靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。 培养用品要有固定的存放地点（培养用品与非培养用品存放分开；已消毒与未消毒品严格分开存放）， 目的：避免各种杂质混入细胞生存环境、防止微生物感染和细胞“污染”。 二、细胞生存条件及代谢 无污染环境 培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。 细胞被置于体外培养后，失去了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物积累等，可导致细胞死亡。 适宜温度 人体细胞的适宜温度为36.5℃+0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。 培养细胞对低温的耐受力比对高温强。 温度不低于0时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用； 对培养液中加一定量的保护剂（甘油或二甲基亚砜），封入安瓿中，冻存于液氮中，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续增殖生长，细胞生物性状不受任何影响，成为保存细胞最主要的手段。 气体和pH值 O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。多数细胞缺氧不能生存。 开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般要把细胞置于95%的空气加5%CO2混合气体环境中。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，主要作用在于能维持培养基的pH值。大多数细胞要求7.2-7.4。 营养物质 糖、无机盐 氨基酸、维生素 促细胞生长因子 牛血清是提供生长因子和细胞所需物质的来源 渗透压 离子强度：260-320 mOsm/Kg 人工培养基 二、实验设备 无菌间、超净台、洗刷间、储存室、实验工作室 孵箱、CO2孵箱、显微镜、纯水器、液氮罐、抽滤装置、离心机、干烤箱、高压灭菌器、加样器 培养器皿、耗材（试管、吸管） 肿瘤细胞生物特性学研究 比较肿瘤细胞与正常细胞在体外培养条件下生长行为的差异，研究肿瘤细胞生物学特性的改变，对于建立诊断标准有益。 肿瘤细胞体外生长形态学研究 肿瘤细胞生长特性 细胞接触抑制实验 肿瘤发病机制研究 肿瘤产生诱发因素的研究 肿瘤细胞侵润机制和过程的研究 肿瘤与正常细胞 共同培养法 研究肿瘤药物筛选 异种移植研究 裸鼠发现与应用 建立了动物移植瘤模型 抗肿瘤药物筛选 研究肿瘤细胞调亡以及肿瘤细胞体外分化又成为新热点 生物治疗 活细胞---体细胞---体内 活化细胞（LAK）---患者 组织---悬液---培养---回输机体 细胞培养： 一、原代培养 二、传代培养 一 原代培养 原代培养（primary culture） 从体内取出组织或细胞的第一次培养 原理 ? ? 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA乙二胺四乙酸）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 ? ? 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） ? ? 材料：动物组织块 ? ? 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求