重组载体pEGFP-N1TNFR1在人脐静脉血管内皮细胞中表达.pdfVIP

重组载体pEGFP-N1/TNFR 1 在人脐静脉血管内皮细 胞中的表达1 叶顺传，曾秋棠，吴辉文，吕云波 华中科技大学同济医学院协和医院心研所，湖北武汉（430022 ） E-mail：yeshunchuan@ 摘 要：目的：构建肿瘤坏死因子受体（TNFR 1 ）绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1/TNFR 1，并在人脐静脉血管内皮细胞中表达。方法：分离并培养 HUVEC ，将已成功构建的融合 表达载体pEGFP-N1/TNFR 1 （另文发表），通过阳离子脂质体Lipofectin 介导的方法转染到 HUVEC 中，RT-PCR 检测mRNA 的表达，Western blot 检测融合蛋白的瞬时表达，同时在 在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察。结果：成功分离人脐静脉血管内皮细胞，重组 pEGFP-N1/TNFR 1 融合表达载体转染HUVEC 细胞后，在细胞中检测到TNFR 1 基因片段， Western blot 可以检测到TNFR 1 在HUVEC 细胞表达，用荧光显微镜观察到转染细胞中有 绿色荧光蛋白表达。结论：重组pEGFP-N1/TNFR 1 融合表达载体在HUVEC 中获得了表达， 融合蛋白具有TNFR 1 和GFP 的双重活性，为进一步研究TNFR 转位的调控因素打下基础。 关键词：TNFR 1；绿色荧光蛋白；人脐静脉血管内皮细胞；克隆 近年的研究表明，肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF ）在心血管疾病，如高血 脂、高血压和动脉粥样硬化（Atherosclerosis ，AS ）等的病理生理过程中起着重要的介质作 [1] 用 。 研究肿瘤坏死因子受体（TNF receptor，TNFR ）是揭示TN F作用机理的重要途径。在 TNF的刺激下，TNFR 1可能从反式高尔基体转位到细胞膜，但是，TNFR 1细胞内转位通路 及调节因子尚不明确[2] 。 本实验在已构建绿色荧光蛋白融合TNFR 1基因的重组载体pEGFP-N1/TNFR 1 的基础 上，拟转染人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells ，HUVECs ），观察 其表达，为进一步研究TNFR 1细胞内转位通路及调节因子奠定基础，并为阐明TNF引起的 细胞损伤机制提供实验依据。 1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂 Trizol 试剂、Lipofectin 脂质体、OPTI-MEM I 无血清培养基购自Invitrogen 公司。RT-PCR 试剂盒购自大连宝生物。PCR 产物纯化试剂盒购自Promega 公司。质粒抽提试剂盒、DNA marker 购自北京天根生化。T4 DNA 连接酶、限制性内切酶Kpn I 、Sac I 购自NEB 公司。I 型胶原酶购自Sigma，内皮细胞培养液(含ECGs、胎牛血清、青/链霉素)购自 TM ScienCell 研究实验室。国产胎牛血清购自杭州四季青。RPMI 1640 培养基购自Hyclone 公司。vWF 因子抗体为武汉博士德公司产品。兔抗人TNFR 1 多克隆抗体、辣根过氧化物酶 （HSP ）标记的山羊抗兔IgG 购自Santa Cruz。ECL 检测试剂盒购自Pierce 公司。引物 的合成和序列测定由上海生工完成。                                                                1本课题得到教育部博士点专项基金资助项目（20040487067 ）的资助。 - 1 - 1.1.2 质粒与菌株 重组pEGFP-N1/TNFR 1 载体在前期实验已成功构建（另文发表），质粒pEGFP-N1 由 华中科技大学同济医学院免疫学国家重点实验室惠赠。 1.2 方法 1.2.1 HUVECs 的分离和培养