无细胞体外表达：方法与应用.pdfVIP

无细胞体外表达：方法和应用 戴吉蕊 博士 技术培训经理 普洛麦格北京生物技术有限公司 2009.2 2008, Promega Corporation. All rights reserved. 内容 •无细胞体外表达的一个实例(JBC文章） •蛋白质生物合成复习 •介绍兔网织红细胞裂解液 •怎样标记和检测所表达的蛋白 •如何准备无细胞表达（以兔网织红细胞提取物系统为例） •无细胞体外表达在科研中的应用 •麦胚芽提取物体外表达系统介绍 • 昆虫体外表达系统介绍 •E.coli S30 提取物系统介绍 •无细胞体外表达的优势 2 无细胞体外表达应用实例 Zheng Q., Yin G., Yan C., Cavet M. and Berk B.C. (2004) 14-3-3beta binds to big mitogen-activated protein kinase 1 (BMK1/ERK5) and regulates BMK1 function. 14-3-3 结合到促细胞分裂剂激活的大蛋白激酶1 （BMK 1/ ERK5)上并调节BMK1功能） J. Biol. Chem. 279(10) , 8787-8791 . 3 研究背景 •BMK1/ERK5 是MAPK家族成员之一 • 以前发现它通过阻止内皮细胞凋亡而防止动脉粥样硬化 •本研究探索BMK1/ERK5的调控机制 4 研究内容 •利用酵母双杂交系统找到了一些能与BMK1结合的蛋白质，其 中有14-3-3蛋白。 •在哺乳动物系统中有有七个不同基因编码的七种14-3-3，序列 高度保守，在细胞浆中普遍表达，单体，分子量30，000 。 •其中14-3-3 在基本条件下与BMK1结合。而激活MEK5 和 BMK1磷酸化就破坏这种结合。 •过量表达14-3-3 抑制EGF激活的BMK1激酶的活性。 •还发现如果486位丝氨酸缺失的BMK1突变蛋白与14-3-3 结合 着的时候，在EGF刺激时，这个BMK1表现出增强的激酶活性。 5 研究方法 • 体外表达BMK1 模板小鼠BMK1cDNA克隆在pcDNA3.1/XprHhis载体 表达系统-- Promega TnT T7 耦联兔网织红细胞裂解液 标记Promega Transcend biotin-lysyl-tRNA • 体系 § 40ul TnT Quick Master Mix § 1ul 1mM methionine § 1ug DNA模板 § 1ul biotin-lysinyl-tRNA § xul H O 2 50ul o 30 C,30分钟 6 GST Pull-Dow n 7 细胞蛋白表达 模板 几小时 质粒DNA PCR 片段 mRNA 转录 mRNA