产γ-氨基丁酸菌株的筛选与发酵.docVIP

产γ-氨基丁酸菌株的筛选与发酵 1. 实验目的 （1）学习运用代谢控制发酵理论设计筛选产γ-氨基丁酸菌株的方法。 （2）对5L发酵罐的使用方法有初步了解。 2. 实验原理 γ-氨基丁酸在茶叶、米胚芽等植物细胞中含量较多，可直接提取制备。或者利用大肠杆菌，霉菌和乳酸菌等微生物细胞生产γ-氨基丁酸也同样可以达到很高的产量。 在微生物细胞中，一分子谷氨酸（L-Glu）在有一个H+存在的条件下脱去α-羧基得到一分子γ-氨基丁酸和一分子CO2（L-Glu+ H+→GABA+CO2），催化反应的酶是谷氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.15， GAD）。谷氨酸脱羧酶是GABA合成过程中的唯一关键限速酶，最适pH在46之间，底物谷氨酸对它有激活作用。在反应过程中随着H+的消耗，培养基pH会逐渐升高，当pH大于6.8时，能够使溴甲酚紫由黄变紫。 还原糖可作为微生物生长发育的碳源和能量来源，pH是调控GAD活性的关键因素，OD600可以用来衡量菌体量的多少，L-Glu和GABA的浓度变化直接反映出底物转化率和产量。因此，在5L发酵罐的发酵试验中，需要对以上几个因素进行检测，以便为优化发酵条件提供试验依据。 3. 实验材料 酸菜汤：来自于市售酸菜或家庭自制的东北酸菜。 培养基 初筛培养基：在MRS培养基中加入溴甲酚紫 0.2%， L-Glu 3%（可用同物质的量的谷氨酸钠代替）和琼脂粉 2%，pH5.0，121℃灭菌20min。溴甲酚紫用过滤器除菌。 种子培养基：液体MRS培养基发酵培养基：在液体MRS培养基中加入3%的L-Glu（可用同物质的量的谷氨酸钠代替），pH5.0。L-Glu可用110℃灭菌10min，以减少高温高压条件下的损失。 （3）仪器及其他用具 5L发酵罐，紫外分光光度计，高效液相色谱仪，层析缸，培养皿，锥形瓶，试管，pH计等。 4. 实验步骤及方法 （1）以无菌操作，用移液管取酸菜汤汁1mL吹于装有9mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，再从这支试管中取1mL吹于下一支装有9mL生理盐水的试管中，充分震荡摇匀。如此往复，将酸菜汤汁稀释10-1010-14倍。取稀释后的汤汁0.1mL涂布在初筛平板培养基上，30℃，培养3648h。 （2）挑取在初筛培养基上长出的，菌落周围培养基变成紫色的单菌落，转接于300mL种子培养基中，30℃静置培养1416h。 （3）取30mL种子培养液转接于另一瓶300mL种子培养基中，30℃静置培养1416h。 （4）将300mL种子培养液接入3L无菌发酵培养基中，30℃静置培养72h。在发酵过程期间采用自动流加HCl和NaOH的方式调节发酵液pH为5.0。以无菌操作，每隔6h取4mL发酵液于无菌试管中，测量OD600，并对pH进行记录。 （5）将取出的发酵液离心取上清，参考DNS测还原糖的方法[1]测定发酵液中葡萄糖的浓度，做记录。 （6）利用纸层析法测定L-Glu和GABA的浓度。展开剂为正丁醇: 冰醋酸: 水=6: 1: 3 (V/V/V)。展开剂中含茚三酮（0.4%、W/V）。发酵液5000r/min离心后，取上清1μL点样，放入层析液中层析8h，90℃烘干20min。以硫酸铜（0.1%）：乙醇（75%）=1：19的洗脱剂将层析点上的颜色洗脱下来，520nm波长下测定吸光值。 （7）还可用高效液相色谱仪测定L-Glu和GABA的浓度。取发酵液上清10μL，加入衍生缓冲液100μL、衍生剂2，4-二硝基氟苯100μL，定容缓冲液790 μL于1.5mL离心管中，混匀，60℃水浴1h。20μl进样。用KromasilC18柱，流速0.8mL/min, 360 nm检测。流动相为乙腈、醋酸钠溶液和水，梯度洗脱（表1）。测定发酵液中L-Glu和GABA的浓度。 表1 梯度洗脱程序 Time A（%） B（%） C（%） Flow(mL/min) 0 10 12 23 33 23 23 23 23 54 44 54 0.8 0.8 0.8 注：A：水。B：乙腈。C：pH6.4 醋酸钠溶液。 （8）发酵结束后将发酵液从罐体中吸出，清洗发酵罐，清洗pH电极、温度电极等，并对其进行正确的保养与储存。 （9）整理实验记录。 5. 试验数据处理 OD600和pH直接从仪器上读取。葡萄糖浓度的数据处理方法参照“DNS法测定葡萄糖的方法”。L-Glu和GABA的数据处理方法参考文献《产γ-氨基丁酸菌株的分离和选育》[2]。 6. 实验报告 实验报告方法可参照下表： Time/h OD600 葡萄糖/% pH L-Glu/% GABA/% 0 0 0 5 5 0 6 . . . . . 12 . . . . . 18 . . . . . . . . . . . 7. 结果与讨论 （1）结合发酵试验数据分析该菌