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蛋白裂解液.doc
蛋白质的定位与蛋白质裂解液的选择:全细胞:NP-40或RIPA细胞质(可溶):Tris-HCl细胞质(细胞骨架):Tris-Triton细胞膜:NP-40或RIPA细胞核:RIPA线粒体:RIPA
RIPA裂解液配方1ml RIPA buffer contains 35μl proteinase inhibitor and 10μl phosphatase inhibitor
RIPA buffer 最终浓度1M Tris-HCl (pH7.5) 5 ml 50mM NaCl 0.87g 0.15 M Na-deoxycholale 0.1g (1%)0.5M EDTA(pH8.0) 0.8ml NaF 41 mg Nonidet P40 1 ml (1%)Aprotinin10μg/μl 100μl 10μg/ml 加水到 100ml
Aprotinin 10μg/μl ;用10mM HEPES-KOH(PH8.0)溶解,备用。
Nonidet P-40简称NP-40,乙基苯基聚乙二醇常用非离子性去垢剂Na-deoxycholale,脱氧胆酸钠,离子型去垢剂离子型去垢剂主要作用有:裂解细胞;溶解蛋白,尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白,如膜蛋白等;很适合做WB,但在Co-IP中使用,需要谨慎在与蛋白相关的检测中,首先最关键的一步便是蛋白质的提取。蛋白质的提取过程中,我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸化蛋白的研究过程中,磷酸酶抑制剂也是必不可少的,本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF,Leupeptin 亮肽素,Aprotinin抑肽酶,Pepstatin胃蛋白酶抑制剂,EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠,Na3VO4 原矾酸钠 ,BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠,Na2P2O4 焦磷酸钠等。对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制,贮存液与工作液浓度,保存都做了详细的说明。蛋白酶抑制剂PMSF:特性:丝氨酸蛋白酶抑制剂,如胰凝乳蛋白酶,胰蛋白酶和凝血酶,也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶(可逆的地面处理)。 溶解性:溶于异丙醇,乙醇,甲醇和丙二醇果>10mg/ml。在水溶液中不稳定。在100%异丙醇, +25时稳定至少9个月分子量:174.2使用:贮存浓度:200mM,工作浓度:1mMLeupeptin 亮肽素特性:抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,纤溶酶,和组织蛋白酶B溶解性:高度溶于水(1mg/ml)。4一周稳定,分成小份冷冻在-20至少6个月分子量:C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6使用:贮存浓度:1mg/ml,工作浓度0.5 ug/ml (1mM)Aprotinin抑肽酶特性:丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制纤维蛋白溶酶, 激肽释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X。溶解性:易溶于水(10mg/ml)或缓冲液(例如,tris,0.1M,pH8.0)。pH约7-8的溶液在4可保存1周,分装保存在-20可至少保存6个月。避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。分子量:6,512使用:贮存浓度:1mg/ml, 工作浓度:0.06–2.0 ug/ml(0.01–0.3 uM)Pepstatin胃蛋白酶抑制剂特性:抑制天冬氨酸(酸)蛋白酶如胃蛋白酶,肾素,组织蛋白酶D,凝乳酶, 许多微生物酸性蛋白酶溶解性:溶于甲醇约1mg/ml; 可溶于乙醇,过夜溶解可达到1 mg/ml;在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。4稳定一周,分装储存于-20时可保存1个月分子量: 685.9使用:贮存浓度:1mg/ml,使用浓度:0.7 μg/ml(1 μM)EDTA-Na2特性:金属蛋白酶抑制剂溶解性:溶于水至0.5M,在pH8-9的条件下,4稳定至少6个月分子量: 372.24使用:工作浓度:0.2–0.5 mg/ml(0.5–1.3 mM),不需现用现配,在溶液pH值调至8-9时再加入。磷酸酶抑制剂NaF氟化钠 溶解性:溶于水分子量: 41.99使用: 贮存液:5M? ? 工作浓度:10-20mMNa3VO4 原矾酸钠 分子量:183.91溶解性:溶于水,我们购买过来的是原矾酸钠.原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用.原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是:100mM原矾酸钠激活储存液配制(1).取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中,加酸调节PH至10(颜色变黄)(2).煮至无色(3).室温冷却(4).重调PH至10(5)重复(1)(2)(
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