2-离子柱层析法课件.ppt

离子树脂柱层析法 一、实验原理与目的要求 1、 实验原理 我们今天所用的阳离子树脂；它的本质其实就是一类高分子物质。 这类高分子物质的一个明显的特点就是，它含有一些可以解离的基团， 例如–SO3H；–COOH等，而这些解离基团可以和溶液中的离子产生 相互反应。 如： R–SO3H + M+ ? R–S03M + H+ 或 R–NH3OH + CL- ? R–NH3CL + OH- 又由于在不断改变给予的洗脱条件的过程中，因不同类型的离子交换剂对各种离子的亲和力不同，因此在离子交换柱上的迁移速度也不同，从而达到分离的目的。本次实验所不同的是，我们所用的是一种恒定的洗脱条件，这是利用分离的样品在该特定条件下亲和力较弱的特点，而使两种氨基酸得到分离。 如: R–SO3H + Lys+;Asp- ? R–S03 Lys + H+ —AspR–S03 Lys + H+ —Asp ? R–S03 H + Lys 洗脱原理 图 2、目的与要求 希望通过本次实验要求我们的同学能够了解离子交换柱层析中是如何装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、收集、测定等柱层析技术的概念和要点。 二、实验主要仪器与器材 1、仪器部分 （1）、紫外可见分光光度计 （2）、自动部分收集器 （3）、恒流泵 （4）、电 炉 （5）、混合器 2、器材部分 （1）、 层析柱（高20.0厘米，内径1.0厘米） （2）、 自动取液器（1000 ul） （3）、 试 管 （10-12支） （4）、 试管架 （5）、 烧 杯 （若干） （6）、 量 筒 （7）、 滴 管 （8）、 玻 棒 （9）、 保膜鲜、标签纸或记号笔等 三、实验主要试剂与配制 1、实验试剂及材料 （1）、 阳离子交换树脂 （2）、 柠檬酸（C6H8O7.H2O） （3）、 氢氧化钠(97%) （4）、 浓硫酸 （5）、 盐 酸 （6）、 赖氨酸 （7）、 天门冬氨酸 （8）、 茚三酮 （9）、 无水乙醇 （10）、95%乙醇 2、试剂配制 （1）pH5.3; 0.45 mol/L柠檬酸缓冲液（平衡、洗涤、洗脱溶液） （2）、盐酸溶液（0.02 mol/ L HCL） （3）、样品溶液（0.005 mol / LASP 和 LYS） （4）、乙醇溶液（60%） （5）、显色剂溶液 (2.0 g茚三酮/100ml无水乙醇) 四、实验装置 图1.实验装置图 实验装置连接图 （1）、恒流泵的进口端放入容器中，出口端与层析柱的进口端（上端）相连接。 （2）、层析柱的出口端（下端）与部分收集器相连接。 （3）、然后将出口端对准收集试管，进行收集。 五、操作方法 操作步骤 1、装 柱 阳离子树脂，柱 高：5.0 cm 2、平 衡 流速：0.4 ml/min，15分钟。 3、上 样 0.5ml 4、洗 涤 洗涤2次 ， 0.5 ml/次。 5、洗 脱 流速：0.4 ml/min 6、收 集 4.0 ml/管/ 10 min，10-12管 7、测 定 具体步骤后叙 友情提醒 （1）、在装柱的同时应接通各仪器电源进行预热，并按要求 不断调试各仪器（如恒流泵的流速、自动部分收集器 的时间设定）。 （2）、在开始上样之前，必须事先启动部分收集器、并开始 进行收集。 （3）、在上样和洗涤阶段利用手动方式进行收集，洗涤结束 后，加洗脱液进行洗脱时，当收集管达到所需体积 （4.0 ml）时，再改换成自动方式进行收集(10-12管)。 六、测定 表1：样品溶液测定方法与结果表 绘图 1-可以用exel制图 2 - 也可以用坐标纸制图,坐标纸的大小为, 长度l0cm宽度8.0cm为宜. 绘制结果图 以光吸收值（A570nm）为纵坐标，收集的管数（或体积）为横坐标绘制洗脱曲线 七、下面具体韶韶仪器的调试 （1）、 紫外可见分光光度计 （2）、 自动部分收集器 （3）、 恒流泵 （4）、 电 炉 （5）、 混合器