圆盘电泳(yuanjie).ppt

实验一  不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 注意事项： 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（C、D）是神经毒性试剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。用完加盖。 TEMED（A、B）要密封保存，用完加盖。 过硫酸铵（G）溶液最好新鲜配制，以防止氧化失效。用完加盖。 核黄素（E）需避光保存。 ◇ 主要过程 ◇ 凝胶柱的制备 加样 电泳 剥胶 固定和染色 漂洗 实验分组（每人做一管，每3-5人配一份胶） ?认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用） ? 封管 ? 分离胶配制与灌胶 （浓度为6%，每组总体积为10ml，灌胶高度为7~8cm） 封正丁醇3mm （手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握15min） 样品处理并加样（20ul）?加buffer?电泳（浓缩胶时3mA/管，分离胶时2mA/管，距底1cm时停止）剥 胶 （一）电泳的基本原理及相关知识 （二）、聚丙烯酰胺凝胶电泳 （三）、实验结果的分析 * * 高级生物化学技术 中山医学院 生物化学与分子生物学教研室 1．凝胶玻璃管的准备（封口） 2．分离胶的制备 3．浓缩胶的制备 4. 装柱 浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为4ml，灌胶高度为1.5cm,留1cm空加样） ? 倒掉正丁醇 灌浓缩胶 ? 封正丁醇3mm（观察界面，判断凝固时间） ? 安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡） 固定（时间5min） 染色（时间2min） 漂洗脱色至背景透亮 ? 电泳的概念 带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定 ? 电泳的基本原理 主要利用分子之间的两个方面的差异来分离： 分子所带电荷 电荷性质（+/-） 电荷数量 分子形态 分子量大小 分子的三维构象形状 ? 电泳分离蛋白质的原理 ? 蛋白质两性解离与等电点 ? 溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质 电荷性质与数量 ? 不同蛋白质分子大小和分子形状 的差异 ? 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类） ? 纸电泳 ? 醋酸纤维膜电泳 ? 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶的聚合速度与温度关系很大，温度低时，聚合速度减慢。 ? 电泳的影响因素 ? 带电粒子的性质 ? 电场强度 ? 溶液的pH ? 溶液的离子强度 ? 电渗现象 ? 环境因素 ? 聚丙烯酰胺凝胶 ? 两单体构成的人工合成凝胶 丙烯酰胺（Acr） N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis） ? 作为电泳介质的优点 自由调节孔径；韧性好；性质稳定； 无电渗作用；无色透明。 ? 合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法 ? 化学合成系统 过硫酸铵（AP） 四甲基乙二胺（TEMED） ? 光学合成系统 核黄素 四甲基乙二胺（TEMED） ? 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理 ? 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 的三个不连续 ? 聚丙烯酰胺凝胶电泳 的三个效应 凝胶孔径不同 缓冲液pH不同 缓冲液离子成分不同 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 Gly - Pro - Cl- Gly - Pro - Cl- Cl- Cl- Cl- Pro - Pro - Pro - Gly - Gly - Gly - pH为8.3的电泳缓冲液（Tris-Gly） pH为6.7的浓缩胶 pH为8.9的分离胶 有效泳动率： MCl- M Pro- M Gly- Gly - Gly - Gly - Cl- Cl- Cl- Pro - Pro - Pro - 快离子Cl 慢离子Gly Gly