检测水体日本血吸虫毛蚴PCR方法建立.pdfVIP

562 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ChineseJournalofZoonoses 2O10，26 (6) 文章编号 ：1002—2694(20t0)06—0562—03 检测水体 日本血吸虫毛蚴 PCR方法的建立* 王延安 ，沈海英 ，申云侠 ，王文波 ，王本敬 ，梁幼生 ，诸 葛洪祥 摘 要 ：目的 建立一种灵敏、特异的痕量检测 日本血吸虫毛蚴的 PCR方法 。方法 取感染 6～8w 日本血吸虫的小 鼠 肝脏 ，碾磨后沉淀，孵化并利用间接连续离心法富集毛蚴 ，采用蛋 白酶K一苯酚法提取毛蚴基 因组DNA。登陆GenBank查询 获得 日本血吸虫保守序列 18S小亚基单位核糖体脱氧核酸(18SrDNA)基 因，利用引物设计软件 PrimerPremier5．0和Oligo 6自主设计一对 引物 ，建立检测 日本血吸虫毛蚴的PCR方法。梯度稀释血吸虫毛蚴基 因组 DNA进行 PCR方法 的灵敏性试 验，设置 阴性对照，PCR产物通过电泳鉴定。结果 PCR扩增 日本血吸虫毛蚴得到特异性 DNA片段 ，片段长度为 463bp，阴 性对照组无扩增产物。PCR法可检测出 日本血吸虫毛蚴 DNA 的最低浓度为 62．5pg／#L。结论 建立 的检测 日本血吸虫毛 蚴PCR方法灵敏 、特 异，具有一定的预警作用。 关键词 ：日本血吸虫；毛蚴 ；PCR；痕量检测 ；预警 中图分类号 ：R383．2 文献标识码 ：A EstablishmentofPCR assayfordetection ofSchistosomajaponicum miracidium inwater W ANG Ting—an ，SHEN Hai—ying ，SHEN Yun-xia ，W ANG W en-bo ， WANGBen-jing ，LIANGYou—sheng。，ZHUGEHong—xiangh (1．DepartmentofPathogenicBiology，CollegeofMedicine，Soochow University，Suzhou215123，China； 2．JiangsuInstituteofParasiticDiseases，Wuxi214064，China) ABSTRACT：Toestablishasensitiveandspecificpolymerasechainreaction(PCR)assayfordetectingSchistosomajaponi— eum (S．japonicum)miracidium，eggsofS．japonicum wereharvestedfrom infectedmicelivers6tO8weeksafterinfection andincubatedwithwateraswellascollectedconsecutivelybycentrifugalization．TheDNA ofS．japonicum miracidium was extractedbyproteinaseK／phenolmethod．Basedon18SsmallsubunitribosomalDNA (18SSSUrDNA)geneofS．japonicum inGenBank，aPCRassayfordetectingmiracidium ofS．japonicumwasestablishedbyPrimerPremier5．0andOligo6．Sensi— tivityofPCR assaywastestedbygradientdilutionofmiracidium DNA．ThenegativecontrolwassetandthePCR products wereidentifiedbye1ectrophoresis．PCR resultswerejudgedwithnakedeyesande1ectrophoreticanalysis，respectively．The positivesignalwithanapproximatelengthof463bpwasobserved