荧光定量PCR试剂盒质量评估方法建立与初步应用.pdfVIP

浙江检验医学 2003 年第 1 卷第 4 期 　Zhejiang Journal of Laboratory Medicine , 2003 , Vol . 1 , No . 4 37 中图分类号 :R392 . 11 　　　　文献标识码 :A 荧光定量 PCR 试剂盒质量评估方法建立及初步应用 黄学忠 ,杜笑雅 ,吴 　祥(解放军第一一八医院 ,浙江温州 325000) 摘要 : 目的　建立一种简捷 、实用的荧光定量 PCR 试剂质量评估方法 。方法 　以扩增反应后的荧光背景 、杂光及其试剂盒标 准曲线的斜率与截距等多参数对其实施质量监控 。结果 　不同品牌荧光定量 PCR 试剂盒标记探针的荧光强度以及背景荧光 差异较大 , 以试剂盒 a 较为理想 ,其标准曲线斜率和截距的批内变异分别为 3 . 106 %和 1. 714 % ,试剂盒的批间变异为 1. 229 % 和 2 . 14 % 。结论 　利用扩增反应后的荧光背景 、杂光及其试剂盒标准曲线斜率与截距对试剂盒实施动态质量监控 ,较经典的 血清盘测定法更为便捷 、实用 。 关键词 :实时荧光定量 ;聚合酶链反应 ;斜率 ;截距 ;质量控制 　　荧光定量 PCR 是 目前核酸定量检测较为理想 界面 ,采用经基线调整和优化的算术描点法模式[2 ] , 和便捷的方法之一 ,但其结果受模板浓度及扩增反 采集标准系列 Ct 值和拷贝数构成的标准曲线斜率 应体系的批间差异影响较大[ 1] 。本文介绍一种荧光 和截距 。按相同方法用同批号试剂连续检测 20 个 定量 PCR 试剂盒质检及评估的方法 ,较经典的血清 批次后分别计算出标准曲线斜率和截距的均值和标 盘测定法更简捷 、实用 。 准差 。 1 　材料与方法 1. 2 . 4 　按文献[ 1 ,3 ] 介绍的方法在 Excel 电子表格中 1. 1 　材料 分别输入每次标准曲线的斜率和截距 , 图表曲线将 1. 1. 1 　随机选择不同品牌的 HBV DNA 荧光定量 自动显示此次结果在质控图上的落点位置 ,并可显 PCR 试剂 ,分别将其编为 a 、b 和 c (a 、b 分别为深圳 示质控趋势以及斜率和截距的均值 、标准差和变异 ) 匹基公司产品 ,c 为另一公司产品 。 系数 。 1. 1. 2 　LihgtCycler 荧光定量 PCR 仪及 Roche 专用毛 2 　结果 细管 , 由瑞士 Roche 公司提供 。 不同品牌荧光定量 PCR 试剂盒标记探针的荧 1. 1. 3 　HBV DNA 阳性和阴性标本 , 由本院门诊和 光强度 以及背景荧光见图 1 。可 以看出 ,试剂盒 a 住院病人提供 。 的标记荧光探针在 Fl/ F2 方式中较为理想 ,且背景 1. 2 　方法 ( ) ( 荧光较低 见图lal ;试剂盒 b 不适于 Fl/ F2 分析 见 1. 2 . 1 　按相关试剂盒说明书介绍的方法提取核酸 图lbl) ;而试剂盒 c 虽荧光本底较低 ,但其扩增曲线 模板后 ,在 Roche 专用毛细管中分别加入扩增反应 的平台趋势不明显 ,说明其所使用的 Taq 酶质量不 ( ) 液和模板提取液或质粒标准系列 ,稍加离心 混匀 够理想 。 后上机扩增 。荧光信号收集方式在 60 ℃时设为 我们选择试剂