血红蛋白作为催化剂高灵敏测定过氧化氢.ppt

引言 痕量 H2O2 的测定不论是在临床生物化学还是在环境化学中都有重要意义。酶法测定 H2O2 一般是基于过氧化物酶催化 H2O2 氧化底物的反应来实现的。 本文用 Hb 作为催化剂催化 H2O2 氧化对甲基酚的反应，建立了测定 H2O2 的高灵敏荧光分析方法。 实验部分 仪器与试剂 实验方法 仪器 RF-5301PC 荧光仪；SFM-25 荧光 仪 ；PH-3C 数字型精密酸度计；GS501 超级恒温槽。 试剂 血红蛋白生化试剂，配成1×10-5 mol/L的水溶液；对-甲酚(99%)移取105.6μL,用二次蒸馏水稀释至100mL，得1×10-2mol/L的储备液；H2O2：移取0.1mL30%的分析纯过氧化氢稀释至100 mL，得1.064×10-2 mol/L的储备液 ，棕色瓶装 ，冰箱保存，使用时依实验需要进行稀释 。所用其他试剂除注明外 ，均为分析试剂，所用水为二次蒸馏水。 在 10 mL 比色管中依次加入系列 H2O2 溶液；1×10-3 mol/L 对甲基酚 1.0 mL ；pH=10.3 的NH3-NH4Cl 缓冲溶液 3.0 mL；1×10-5 mol/L血红蛋白 0.50 mL 。用二次水定容，混合均匀后，室温放置 10min ，测定产物在激发波长 318nm ，发射波长 427nm 处的荧光强度。 ☆ 体系的荧光光谱 用血红蛋白催化对甲基酚与H2O2的反应得到的荧光产物为2,2’ - 二羟基 – 4，4’- 二甲基联苯，其荧光的激发和发射光谱如图1（a），最大激发和发射波长为λex / λem =318nm/427nm 。 需要指出的是，血红蛋白在本实验条件下亦产生微弱的荧光，这是由于其分子中肽链上的色氨酸和酪氨酸所致。然而其最大激发和发射波长为λex / λem =318nm/427nm（如图1 b）对本体系只产生微弱的本底值 。 血红蛋白的催化活性比较 基于血红蛋白的上述结构特点，我们研究了对甲基酚浓度对血红蛋白催化反应速率的影响情况。实验结果显示，当对甲基酚浓度较低时，其与反应速率成正比，表现为一级反应。随着对甲基酚浓度的增高，表现为混合级反应。当对甲基酚浓度大于3×10-4mol/L 时，反应速率不再上升，此时反应速率与对甲基酚浓度无关，表现为零级反应。 血红蛋白的催化活性比较 利用Linewear-Burk图，由截距和斜率求得Vm = 1.6 min-1 ，K m = 8.75×10-4mol/L，再由方程：Vm = Kcat [ E 0 ] 求得酶催化的转换数 Kcat = 6.4×106L/ mol·min 。 血红蛋白的催化活性比较 按同样方法实验测得了氯化血红素和合成的环糊精-氯化血红素（β-CD-Hemin）等过氧化物模拟酶的 K m 、V m 和 K cat 值(表1)。比较发现，这3种铁卟啉化合物对底物对甲基酚的催化氧化活性顺序为 ： Hb ＞β-CD-Hemin＞Hemin 过氧化氢测定条件的选择 酸度及氨浓度 酸度是酶催化反应需要用缓冲溶液严格控制的条件之一。我们比较了NH3-NH4Cl、甘氨酸-NaOH、硼砂-NaOH、NaHCO3及混合酸-NaOH等缓冲体系。发现在NH3-NH4Cl缓冲溶液中，当pH 10.3时产物的荧光强度最大。同时我们固定这一酸度实验了NH3浓度对体系荧光强度的影响情况，结果显示的最佳氨浓度是0.03mol/L。表明血红蛋白的催化活性也可被氮配体（如NH3）所增强。 对甲基酚浓度 对甲基酚作为酶催化反应的氢供体，浓度太低，将使反应不完全而导致信号太弱；浓度太高，亦可使信号损失，并且造成浪费和环境污染。为此，本实验选择的对甲基酚浓度为1×10-4 mol/L。 血红蛋白（Hb）的浓度 由于血红蛋白是一荧光物质 ，尽管在本实验选定的条件下荧光强度很弱，然而当其浓度太大时，会导致较大的空白值，并且造成浪费。当浓度很低时，在测定时间内催化反应不完全。实验结果表明：当血红蛋白浓度在 2×10-7 ～6×10-7 mol/L时，体系荧光强度最大且恒定 。 本实验选择5×10-7mol/L为最佳用量。 分析方法特性 按选择的实验条件测定了H2O2 ； 在3.19×10-8～3.19×10-6mol/L范围内，线性方程为F =26.83 + 2