载体表达siRNA抑制HBV复制和基因表达.pdfVIP

维普资讯 第 52卷 第 4期 武汉大学学报 (理学版) Vo1．52 No．4 2006年 8月 J．WuhanUniv．(Nat．Sci．Ed．) Aug．2006，466~ 470 文章编号 ：1671—8836(2006)04—0466—05 载体表达 siRNA抑制 HBV复制与基因表达 吴 浩，邬开朗，朱 应，吴建国，杨复华 (武汉大学 生命科学学院／病毒学国家重点实验室，湖北 武汉 430072) 摘 要 ：用载体表达 siRNA的方法并通过 RNA干扰达到抑制乙型肝炎病毒 (HBV)的复制及其基因的表达．针 对 HBV的s基因选取4个靶位点，并将 目的基因与荧光素酶报道基因构成快速筛选系统，从4个位点中筛选到一个 有效的作用位点．用半定量 RT-PCR、ELISA、Westernb1ot和荧光定量 PCR等方法对筛选到的有效位点进行 了验证 ， 结果表明，siRNA成功降解了HBVS基因的mRNA，降低了s蛋 白的表达水平，有效地抑制了HBV的复制． 关 键 词 ：RNA干扰 ；小分子干扰 RNA；乙型肝炎病毒 中图分类号：Q939．47 文献标识码 ：A 术有望克服上述困难．本研究即通过 自行构建能在 0 引 言 细胞内转录出功能性 siRNA 的载体 ，并将其用于干 扰乙肝病毒 s基因的表达和病毒复制 ，为下一步基 据统计，全世界大约有 3．5亿 乙型肝炎病毒 因功能和治疗手段的研究奠定 了基础． (HBV)慢性感染者．乙型肝炎病毒的长期存在，可 以导致肝细胞持续损害和肝纤维化 ，甚至发展为肝 硬化、肝癌 [1j．过去的2O年中，虽然疫苗计划免疫 降 1 材料与方法 低了急性 、慢性乙肝病毒感染的发生率 ，一些抗病毒 1．1 材料 药物的合理应用也使很大一部分患者的病情得以控 Bel一7402和 HepG2．2．15细胞由中国典型培养 制[2j，但是 ，抗 HBV治疗 ，阻断肝细胞 内肝炎病毒 物保藏中心提供．HepG2．2．15细胞是其基 因组上 基因的复制和表达 ，仍是 目前难题之一． RNA干扰 (RNA interference，RNAi)是指 内 整合了头尾相连的 HBV全基 因组序列 HepG2细 源性或外源性双链 RNA(dsRNA)介 导 的细胞 内 胞系，Bel一7402为肝癌细胞系． mRNA发生特异性降解，从而导致靶基 因的表达沉 siRNA表达载体 H1一pGEM、荧光素酶报道基 默 ，产生相应的功能表型的缺失现象 ]．RNA干扰 因plucF由本实验室构建 ]．pCMV—flag一2A 购 自 技术近年来 日益受到人们 的重视，已被广泛应用到 Clonetech公司．高纯质粒提取试剂盒购 自上海申能 基因的功能、细胞信号转导途径分析、冗余基因的确 博采生物技术有限公司．PCR凝胶 回收试剂盒购于 定、药物开发中靶标验证 、基 因治疗等研究中 ]．目 MBI公司．荧光色素酶分析系统购 自美 国Promega 前在抗病毒感染方面 已经对很多种病毒进行了深入 公司．TrizolR购 自美 国 Invitrogen公司．HBsAg 的研究，这些研究在细胞水平显示了RNAi对病毒 检测试剂盒购于上海科华公司．HBs抗体购 自Sig— 的基因表达和复制有显著的抑制作用_5I．