【精品】细胞工程-细胞融合与单克隆抗体.pptVIP

只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology ）。 Niels K. Jerne G. Kohler C. Milstein 二、杂交瘤技术的基本原理 三、杂交瘤细胞的制备 （一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基 骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体 选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-） HAT培养基 次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基喋呤（aminopterin， A） 胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine， T） 次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-） （二）免疫小鼠 免疫程序是取6—8周龄Balb／C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，3—5天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为loo?g，第二次为50?g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1×l06一1×107。 （三）脾细胞的制备 (1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表； (2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次； (3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中； (4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗， 令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养 液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可； (5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中 置5分钟； (6)离心(800一1000转／分)计数、备用。 （四）细胞准备 （1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不少于90％)； （2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，并计细胞数和测定活力细胞； （3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤 纸吸 净多余上清。 （五）细胞融合 (1)将1ml 40％的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微 转动离心管或用手指轻弹离心管； (2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完； (3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感， (4)离心(800转／分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀； (5)取96孔板，每孔加50?l； (6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50P1； (7)送入5％CO2，温箱中37℃培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。 （六）融合后细胞培养 (1)融合后7—10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的) 后每隔2—3天 半量换液一次； (2)两周后可改用HA培养液半量换液，或仍用HAT培养液； (3)2—3周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明； (4)待集落增殖生长至1／3孔时，应进行抗体检测。 HAT培养基 次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基喋呤（aminopterin， A） 胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine， T） 次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-） （七）抗体检测 免疫荧光试验 放射免疫试验(RIA) 联免疫吸附试验(ELISA) （八）单克隆抗体的大量制备 体内法 培养法 四、单克隆抗体的应用 单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病 诊断，以提高疾病诊断的准确性。 利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成 本，同时也增加了疫苗的安全性。 单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜 在技术。 单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不 断发展。 第五节 人源单克隆抗体 主要困难 （1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力； （2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对