PEG接枝PDMAEMA作为DNA疫苗载体研究.pdfVIP

第二届全国病毒性肝炎和艾滋病实验室诊断与临床高峰论坛 乔勇黄扬岳鑫业仇超邓联东万延民邢金峰张聪优袁松华董岸杰徐建青 DNA载体主要分为两类：一种是病毒载体， 另一种是非病毒载体。目前，病毒类载体依然是 5 最有效的一类载体。但是病毒载体本身存在许多 (BIBS)购自中国盐城科利达化工有限公司，2，2’- 不足，主要体现在免疫原性高、靶向特异性差、制 联毗啶购自北京石鹰化工厂，CuBr为本实验室自 备较复杂、费用较高及安全性顾虑等方面。病毒 制，二氯甲烷(天津江天化工)，乙醚(天津大茂 载体在DNA疫苗中应用的最大障碍之一就是病化工)，四氢呋喃(天津江天化工)均为分析纯。 毒载体本身存在免疫原性，从而导致疫苗在引起 DMEM培养基．胎牛血清和磷酸盐缓冲溶液(pH= 抗原特异性应答之前就可能被清除。与之相反， Mn=60 没有载体的DNA疫苗不存在以上问题，但是转染 000)、二甲基亚砜(DMSO)和噻唑兰 效率的低下却限制了它的应用。 因此，非病毒载体被研究者们认为是最有前途 公司。 的—类载体【l】。阳离子聚合物作为非病毒载体中 最重要的载体种类之一。具有取代病毒载体的潜 力【2】。其中。PDMAEMA作为被广泛研究的阳离子 聚合物载体之一，能通过静电相互作用与DNA结 合，从而提高基因转染效率，是一种很有应用前景 的载体睁41。但是．高细胞毒性却成为限制这种载 体发展的最大障碍睁们。为了改善PDMAEMA的毒 图1 mPEG-b-PDMAEM^结构示意图 性．我们通过ATRP合成了W_E,-b-PDMAEMA。然后 研究了聚合物与DNA的复合行为及PEG化对体外 考文献[7】，我们以mPEC,-Br作为大分子引发剂， 转染效率和细胞毒性的影响，并且考察了PEC,-b- CuBr作为催化剂，2，2’．联吡啶作为配体，水／异丙 PDMAEMA作为载体的DNA疫苗的免疫原性。 结构如图l所示。作为对照，我们还合成了 材料与方法 PDMAEMA均聚物。上述聚合物的核磁和GPC I．材料：甲基丙烯酸N．N．二甲氨基乙醇 测量数据如表1所示。 裘l本文所用聚合物的分子■及分布 注：‘M．为1H-NMR测量值；‘M．和Pelydi印emity为GPc测量值 作者单位：加啷2天津大学(乔勇、岳鑫业、邢金峰、董岸杰)；上海复且大学生物医学研究院复旦大学附属公共卫生临床中心 (黄杨、仇超、万廷民、张聪优、囊松华)；中国疾病预防控爿中心性病艾滋病预防控制中心传染病预防与控制国家置点实验室(徐建青) ··179·—-—- 第二届全国病毒性肝炎和艾滋病实验室诊断与临床高峰论坛 3．细胞培养：实验中体外转染和细胞毒性试验 10’／孔，转染当天，吸出培养液。用无血清、无抗生 所用细胞为293T淋巴细胞，细胞培养液为含有10％素的DMEM培养液孵育细胞。将制备好的聚合 U／面青霉素和100 FIE，100 gg／ml链霉素的DMEM物／DNA复合物加到细胞上，每个剂量傲3个复 培养液。培养箱温度为3r7cc，C02浓度为5％。孔。在37℃5％CO：细胞培养箱中孵育4h后，将 4．聚合物／DNA复合物的制备：用质粒孔内溶液全部吸出，更换为含有2％FBS的DMEM SVl．0 pEGFP为本实验室通过在质粒载体pDRVI培养液。48h后，消化细胞后流式细胞仪定量 (中国CDC赠)中插入增强型绿色荧光蛋白基因EGFP阳性细胞。 构建。文中聚合物和DNA的电荷比均用氮磷比 用MTr法测定转染试剂的细胞毒性。将 表示(N／P，即聚合物中可离子化的氨基与DNA293T淋巴细胞于转染前24h左右在96孔板铺 中磷酸基团的摩尔比)。 板，细胞数目为1×104／孔．转染方案与上述相同．