非程序性DNA合成试验.docVIP

1? 范围本方法规定了非程序性DNA合成试验的基本技术要求。本方法适用于评价保健食品的诱变性和/或致癌性。用这种短期筛选方法可以检测出一些短期体外试验法所不能检出的诱变剂和/或致癌剂。?2 术语和定义下列术语和定义适用于本方法。非程序性DNA合成（Unscheduled DNA Synthesis，UDS）：当DNA受损伤时，损伤修复的DNA合成主要在S期以外的其它细胞周期，称非程序性DNA合成。?3 原理正常情况下，于细胞有丝分裂周期中，仅S期是DNA合成期。当DNA受损伤时，损伤修复的DNA合成主要在其它细胞周期，称程序外DNA合成，即UDS，因此发现UDS增高，即表明DNA发生过损伤。在体外培养细胞中，用UDS的测量来显示DNA修复合成的主要关键在于如何鉴别很高水平的半保留DNA复制和水平较低（充其量只有半保留DNA复制的5％）的UDS 。这可以用同步培养将细胞阻断于G1期并用药物（常用羟基脲）抑制残留的半保留DNA复制后显示。同步培养可用缺乏必需氨基酸精氨酸的培养基（ADM）使DNA合成的始动受阻而使细胞同步于G1期。在这些半保留DNA合成明显抑制和阻断了的细胞中，UDS即可用3H-胸腺嘧啶核苷的掺入增加显示。它可用放射自显影或液体闪烁计数法进行测量。?4 试剂与器材4.1 试剂 全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为双蒸水。4.1.1 参考阳性物对照物：可用7,12-二甲基苯并蒽（7,12-dimethylbenzathracene），2-乙酰氨基芴（2-acetylaminofluorene），4-硝基喹啉氧化物（4-nitroquinoline oxide），N-甲基亚硝胺（N-dimethylnitrosamine）。 细胞增殖用培养基：Eagle氏最低要求培养基（Minimal Essential Medium，简称EMEM）85份，小牛血清15份，加入青霉素、链霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及100 mg/mL。EMEM 培养基可选用各种商品供应之粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除菌。4℃ 冰箱贮存。4.1.2 同步用培养基：不含精氨酸之Eagle 氏MEM 培养基（ADM）98份，小牛血清2 份，青霉素、链霉素浓度同细胞增殖用培养基。4.1.3 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）贮液A：将氯化钠160 g，氯化钾8 g，硫酸镁（MgSO4?7H2O）2 g 及氯化镁（MgCl2?6H2O）2 g溶于800 mL双蒸水（50～60℃）中 。另取无水氯化钙2.8 g溶于100 mL 双蒸水中。将上述两溶液混合后，加水至1000 mL ，加入三氯甲烷2 mL ，保存于4℃冰箱中。贮液B：将磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）3.04 g（或 Na2HPO4?2H2O 1.2 g）、磷酸二氢钾（KH2PO4?2H2O）1.2 g （或KH2PO4 0.95 g ）、葡萄糖20 g溶解于800 mL双蒸水中，加入100 mL 0.4％ 酚红溶液（取酚红1 g ，溶于 3mL 1mol/L氢氧化钠中，待完全溶解后，加入双蒸水中至250 mL），加水至1 000 mL，加入三氯甲烷2 mL，保存于4℃ 冰箱中。??? 贮液C：1.4％ 碳酸氢钠以双蒸水配制。??? 应用液的配制：取A液1份，B液1份，水18份，混合后分装于玻璃容器内；高压灭菌，4保存。用前加入1.4％碳酸氢钠，将pH调整至7.2～7.4 。4.1.4? 磷酸缓冲液（无钙、镁的 Dulbecco 氏磷酸缓冲液）（pH 7.4）取氯化钠8.00g 、磷酸二氢钾 0.20g、氯化钾 0.20g 、磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）2.89 g 溶于1000 mL 双蒸水中。4.1.5? 0.02％ 乙二胺四乙酰二钠或四钠（EDTA）溶液。取EDTA 0.2 g 溶于无钙、镁之磷酸缓冲液中，使成1000 mL。高压灭菌后使用。4.1.6? 抗菌素贮存液取临床注射用青霉素G 100万单位及链霉素1 g之粉针，在无菌操作下溶于100 mL之灭菌蒸馏水中，使青霉素及链霉素在溶液中之浓度分别为1万单位及10 000 mg/mL，使用时每100 mL培养基中加入抗菌素贮存液1 mL 。4.1.7? 大鼠肝微粒体S-9组分的制备：按GB15193 .4 执行。 S—9 混合液可按以下方式配制：将磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O） 86.8 mg、磷酸二氢钾7.0 mg、氯化镁（MgCl2?6H2O）8.1 mg、6-磷酸葡萄糖（G-6-P）5.4 mg、辅酶Ⅱ(COⅡ)（纯度90％）4 mg 溶于ADM中，加入l mol/L N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（H