蛋白质测定方法比较.docVIP

方法 ? ? 灵敏度 ? 时间 ? 原理 ? 干扰物质 ? 说明 ? ? ? ? ? ? 凯氏定氮法（Kjedahl法） ? ? 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ?2％ ? ? 费时 ? ? 8～10小时 ? ? 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 ? ? 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） ? ? 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 ? ? 双缩脲法（Biuret法） ? ? 灵敏度低 ? ? 1～20mg ? ? 中速 ? ? 20~30分钟 ? ? 多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物 ? ? 硫酸铵； ? ? Tris缓冲液； ? ? 某些氨基酸 ? ? 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 ? ? 紫外吸收法 ? ? 较为灵敏 ? ? 50～100?g，比色杯的最小测量体积为0.1ml ? ? 快速 ? ? 5～10分钟 ? ? 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 ? ? 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 ? ? 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用 ? ? Folin－酚试剂法（Lowry法） ? ? 灵敏度高 ? ? ～5?g ? ? 慢速 ? ? 40～60分钟 ? ? 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 ? ? 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 ? ? 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化; 标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差 ? ? 考马斯亮蓝法(Bradford法) ? ? 灵敏度更高 ? ? 1～5?g,最小测量体积0.1ml ? ? 快速 ? ? 5～15分钟 ? ? 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其?max由465nm变为595nm ? ? 强碱性缓冲液；TritonX-100; ? ? SDS ? ? 较好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化; 标准曲线有轻微的非线性 ? ? BCA法 ? ? 灵敏度非常高20～200?g,微量BCA为 0.5～10?g ? ? 较快速40分钟内 ? 在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+ ? ? ? 螯合剂；略高浓度的还原剂 ? ? 抗干扰能力强， ? ? 蛋白不可逆的变性