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第八章  病毒学研究方法简介 病毒学研究的主要方法 一、生物学特性测定 二、病毒的分离与培养 要证明某种疾病是某一感染因子所引起．则必须满足Rivers法则： ① 从患病者体内分离出病毒； ② 在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③ 证明这种培养物具有滤过性； ④ 在原始宿主或相关种内能产生同样的病症； ⑤ 能重新分离出病毒。 病毒的分离与鉴定组成了病毒学诊断技术的主体。 病毒分离(virus isolation)是诊断病毒感染的“金标准”(goldstandard)。 标本采集和运送 二、病毒的分离与培养 （一）病毒的纯化与提纯 混合感染的病毒分离 病毒纯化中的必要参考属性： 1. 稀释限点(dilution end point, DEP) 抽提液稀释到最后一个尚有侵染力的稀释度 2. 钝化温度(thermal inactivation point, TIP) 病毒在未加处理的抽提液中，在某一温度时暴露10min而达到完全钝化 3. 体外存活期(L) 病毒在抽提液中放在20~22℃条件下，能保持多少时间的侵染力。 4. 沉降系数与分子量 沉降系数S在20℃下1达因的引力场中的沉降的速度（cm/s) 常用1000×，植物病毒在50~几千S （二）病毒提纯的原理 （三）病毒提纯的技术 （三）病毒提纯的技术 （三）病毒提纯的技术 （三）病毒提纯的技术 （三）病毒提纯的技术 （四）植物病毒提纯举例1 （四）植物病毒提纯举例2 病毒学研究的主要方法 三、病毒的光镜与电镜观察法 三、病毒的电镜观察法 1、正染法（超薄切片法、病组织） 将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒，通常1~2 d完成。 操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过程。 2、负染法 直接将病毒悬液(也可用细胞)滴在铜网上，用重金属(通常用磷钨酸)进行染色，观察病毒颗粒，10-20min可出结果。 原理：负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上显示亮区——较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。 缺点：敏感性低，要求病毒量在107／mL以上，同科病毒难于鉴别。 3、投影技术 4、胶体金标记技术、与免疫学技术结合等 电镜技术的应用 研究病毒形态、鉴定 观察病毒的形态及形态发生学过程；亚显微结构；病毒与宿主细胞的关系；病毒感染细胞的超微结构改变；病毒的分类等。 诊断病毒病 检测不能在体外培养的病毒，如轮状病毒、星状病毒、嵌杯病毒、HAV等都是用电镜最先发现的——能进一步发现新的病毒和病毒病。 四、免疫学技术 五、分子生物学技术 本章要点 6、电泳法 普通电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等 7、柱层析法 吸 附：用离子交换或吸附法 分子筛：琼脂糖或葡聚糖制成凝胶柱 8、抗血清处理 针对寄主蛋白的血清来沉淀杂蛋白 加病毒的抗血清形成病毒—抗体复合物 二、病毒的分离与培养 硫酸铵沉淀法 PVX病植株汁液 澄清的汁液+饱和硫酸铵 2 ：1 去上清，沉淀悬浮在生理盐水或buffer 静置30min 11500g 离心 10min 流水透析2h， buffer或生理盐水透析1夜 3800g 离心 10min，去杂质 也可低速离心 提纯的病毒悬液可直接使用，也可进一步重复沉淀提纯 弃沉淀，上层即为提纯的病毒悬液 超速离心法 CMV病叶+ buffer+巯基乙酸，匀浆 500g 离心 15min，留上清液 80000g 离心30min,留沉淀+缓冲液 澄清液+聚乙二醇，溶解后静置30min（沉淀病毒） 低速离心10min（5000g) 保留上清液 超速离心 150min (75000g) 留沉淀，缓冲液悬浮 15000g 离心20min, 保留上清液 上清液即为提纯的病毒悬液，也 可 重复进一步提纯 动物培养 鸡胚培养 组织培养 原代细胞：新鲜组织+胰蛋白酶消化，分散+培养液 成——单层细胞 二倍体细胞株：原代细胞传代（为二倍体细胞） 传代细胞系：肿瘤组织或二倍体细胞自发转化（非整倍体） 动物病毒的培养 二、病毒的分离与培养 生物学特性测定:在寄主上的反应——症状、传播等 病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法 光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况 免疫学技术：以血清学和