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ELISA 实验操作中的注意要点实验操作中的注意要点 实验操作中的注意要点实验操作中的注意要点 【日期：2009-2-4 16:37:15 | 浏览次数：101 】 ELISA 是免疫学检测、诊断研究最常用的方法之一，对于ELISA 的检测原理、操作规程都有明确的文 献可供参考。ELISA 的试剂盒也多种多样，一般只要严格遵照试剂盒所附说明书操作，均能得到理想的结 果。这里对实际操作的过程做几点说明： 1 样本准备 血清、血浆、体液、细胞培养上清等均可作为ELISA 的检测样本。在采集血样和分离血清的过程中应 尽可能避免溶血。分离血清时最好在室温或者37 ℃水浴中凝固，而不要放在冰箱凝固。ELISA 血清样本 要求新鲜，如果要贮藏后再检测，应分装在-20 ℃以下，避免反复冻融。 2 加样操作 目前ELISA 试剂盒中使用最多的是检测抗原的“双抗体夹心法”和检测抗体的“间接法”，检测的第一步均 是加样本。加样操作需要注意的是应使样本均匀分布到96 孔板的孔底。在加样量为50µl （以下）时，容 易出现将样本加到孔壁的情况，应尽可能避免。多数试剂盒所检测的样本量为100µl，因此这个问题并不 经常出现。随后加入标记抗体、显色底物时均应注意加到孔底。 3 孵育洗涤 孵育一般要求为37 ℃，需要用封板膜对96 孔板进行密封，然后在37 ℃温箱内进行。ELISA 及其他 在96 孔板上进行的免疫学检测反应最重要的步骤便是洗涤。洗涤可在自动洗板机上进行，亦可手工洗涤。 自动洗板机洗涤时，应注意洗涤程序是否符合ELISA 及试剂盒说明书的要求。一般要求洗涤3-5 次，每次 2-3 分钟。需要注意的是，ELISA 反应的洗涤，在每次洗涤过程中各反应孔是注满洗涤液的，即洗涤液是 在反应孔中维持2-3 分钟。而其他一些方法 （如时间分辨荧光检测）的洗涤要求是，反应孔注满洗涤液后 即迅速将洗涤液吸尽。因此在使用多功能自动洗板机的时候应该注意这一点。手工洗涤时，可使用洗瓶或 者输液瓶来向反应孔注液。手工洗涤第一次洗涤可以采用“过洗”，即甩干样本后，快速浸满洗涤液迅速甩 干，这可以进一步避免交叉污染。手工洗涤后要求将平板在吸水纸上拍干，此时应注意：1，勤换吸水纸， 务必避免吸水纸的碎屑粘到反应孔内；2，ELISA 一般能够承受力度较大的“拍板” （而时间分辨荧光等不能， 这也是两种方法在自动洗板机上洗涤程序不同的原因），因此最好对96 孔板上的可拆卸板条进行标记，以 防板条脱落而混淆。 4 结果判断 ELISA 结果判断一般是根据显色底物的显色深浅进行的。显色反应仍要求在37 ℃下进行，约需10 分 钟，然后用终止液终止显色反应，并用酶标仪检测特定波长下的吸光度。由于酶标仪对各反应孔的检测光 路是垂直方向的，因此在进行检测时，应保持各反应孔孔底的整洁；同时，显色底物、终止液的量也应该 准确，因为孔内液体的量将影响到最后的读数。 一．ELISA 试验有效性与三项对照 什么是 “有效性”（Validity ）？要获得准确的检测结果 “有效性”评价，就会关系到：为什 么要设置“阴性、阳性和空白”等不可缺少的三项对照？要用什么样的物质担当“阴性、阳 性和空白对照 （品）”？这“三项对照”如何设置、需要设置几个孔位？获得的测定值如何 “认可、取舍与计算”？随后，又如何依照阳性对照均值 （PCx ）与阴性对照均值 （NCx ） 的差值 （P-N ，或N-P ）大小做出“试验结果有效性”的最终裁决呢？…等等，这一连串的 问题，在国外 “正规”品牌的ELISA 试剂 《使用说明书》中都有明细和详尽的说明。既有 理论要点提示，又有具体细致的举例解说。很可惜，在90 年前后，国内兴起ELISA 检测热 潮之际，在一片 “国外试剂说明书太详细、太复杂、不容易看明白、…”等等 “一片埋冤” 声中，正好迎合国内商家的 “意愿”。从此以后，国产ELISA 试剂的说明书，越来越简单。 这其中商家就有两个 “好处”：好处之一，用A4 、或B5 ，甚至比B5 还要小的一张纸，代 替国际试剂的好几页的 “使用说明书”（等同于一份“操作手册”），每年就可节省一大笔印 刷成本费；好处之二，如同国际试剂说明书上向用户交待的各种表明本试剂质量有关的详尽 内容，国产试剂的所谓“说明书”上统统可以