ERIC-PCR指纹图谱技术在分子生态学中的应用.pdfVIP

实验二 ERIC-PCR 指纹图谱技术在分子生态学中的应用 一、实验原理 1991年，Hulton （6 ）等人首次在E. coli, Salmonella typhimurium及其它肠道细菌基因组 中发现了ERIC （Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus ）序列，即肠杆菌基因间保守 重复序列。同年，Versalovic等人（8）发明针对ERIC序列设计引物并进行PCR扩增的技术， 以用于对细菌的基因组DNA进行指纹图分析，并将该技术申报专利。此后，ERIC-PCR技术 就被广泛应用于细菌分类和菌种鉴别上（2 ）。 1997年，Gillings 和 Holley发现(5), ERIC-PCR可以从植物、脊椎动物、无脊椎动物、 真菌等物种的基因组DNA 中扩增出稳定的、多态性丰富的图谱，而这些生物的基因组中是 没有典型的ERIC重复序列的。因此，并不需要有ERIC序列就可以获得多态性丰富的、可以 反映底物序列差异的图谱。Gillings 和 Holley还进一步证实，ERIC-PCR不是一种专门扩增 ERIC序列的技术，它与其它多种针对重复序列的PCR分型技术，例如REP-PCR 、BOX-PCR 等一样，实际上是一种“长引物随机PCR技术(long primer RAPD, LP-RAPD) ”（4 ）。长引 物随机PCR技术与普通RAPD技术不同之处有两个：1）使用一对长度大于16 碱基的引物， 而不是普通RAPD那样的长度只有8－10个碱基的单个引物；2 ）退火温度高于52℃，而不是 普通RAPD 的低于40 ℃。正是由于这两个特点，这种长引物随机PCR技术与普通的RAPD技 术相比，具有图谱稳定、重复性高，对底物的序列差异敏感性高以及产生的图谱多态性丰富 等特点。 1999年，ERIC-PCR首次被用于分析混合菌群（2 ）。Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6 种纯菌组成的混合菌的组成，获得了高重复性的指纹图谱，该指纹图谱与ARDRA及常规 RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征。Di Giovanni 还用ERIC-PCR成功分析了接种不同 植物根际微生物的BIOLOG GN板不同点样孔中菌群组成的差异（1），提示ERIC-PCR指纹 图谱技术将会成为一项比较细菌群落组成的有效的方法。本实验室经过反复摸索和优化，首 次将ERIC-PCR方法引入复杂环境微生物群落的研究。该方法的理论依据为：用ERIC-PCR 技术研究自然界复杂环境样品，首先需直接提取优质的环境样品中微生物的总基因组DNA ， 其中 DNA分子的种类及各分子的相对比例反应了环境样品中菌群的种类数量及种群之间 的相对比例，这样便提取到生态系统中微生物群落结构的组成信息。不同的环境样品DNA 分子的组成及相对数量不同，重复序列在不同基因组DNA分子中分布及拷贝数均不相同， 这种差异可以反应在ERIC-PCR获得的指纹图谱中。在多种细菌组成的微生物群落中，各种 细菌当其种群数量超过总数量的1-10%时，其特征性ERIC-PCR主条带就可以在群落结构 DNA指纹图中表现出来。因此，在得到的ERIC-PCR指纹图中，每一条带可以是来自若干种 不同微生物的基因组DNA片段，条带的数目反映微生物类群的多少，每一条带的亮度反映 该类群微生物种群数量的高低，这样，生态系统中微生物群落的结构信息，就被间接地记录 在ERIC-PCR 的指纹图谱中。因此，分析不同环境样品中微生物混合DNA经ERIC-PCR获得 的指纹图谱的差异，就可分析比较不同生态系统微生物群落的结构的差异，或者同一个群落 在不同功能状态下的种群结构的变化情况。 本实验室已成功运用ERIC-PCR指纹图谱技术分析人或动物肠道菌群、活性污泥、土壤 等多种微生物群落的结构（1，7，9-13 ）。高平平等人用ERIC-PCR技术对焦化废水处理系统 中的活性污泥种群结构进行了8个时间点的连续动态研究，发现ERIC-PCR 图谱中一条为 2.1Kb 的DNA条带的消长与活性污泥的苯酚降解效率表现出一定的正相关，可能是一些主要 功能降解菌的特征性条带（7 ）。对该片断进行回收、克隆、序列多态性分析及测序分析，并 设计了特异性引物，为下一步用分子生物学方法分离废水处理系统中的主要功能降解菌指明 了方向（10）。Wei等用ERIC-PCR指纹图谱技术分析了12个不同个体的人及仔猪的肠道菌群 结构，获得了清晰、可重复的图谱，并