三氧化二砷对心肌细胞的毒性及其机制的探讨.pdfVIP

三氧化二砷对心肌细胞的毒性及其机制的探讨1 柴丽敏，赵晓燕，吕延杰，杨宝峰 哈尔滨医科大学药理学教研室，黑龙江省生物医药重点实验室，黑龙江哈尔滨（150081 ） 摘 要：目的 探讨三氧化二砷（As2O3 ）对H9c2心肌细胞株凋亡的诱导作用,探讨其机制。 方法 H9c2 细胞培养，不同浓度As O 干预后，采用MTT 、AO/EB 染色法、CaspACE 检测 2 3 系统观察细胞存活率、形态并检测凋亡。结果As O (2-10µM)使H9c2心肌细胞株活力下降； 2 3 AO/EB 染色法观察可见细胞凋亡的特征形态；caspase-3 阻断剂Ac-DEVD-CHO 可以阻断 As O 诱导的凋亡。结论 三氧化二砷诱导的H9c2心肌细胞株凋亡，caspase-3的激活是其所 2 3 致凋亡的机制之一。 关键词：三氧化二砷；细胞凋亡；Caspase-3 砷是砒霜的主要成分，作为医疗用药已有2000 多年的历史，用于治疗癌症、梅毒、结 核等[1]，并在治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)过程中显示出 显著的疗效[2]。但在治疗APL 的同时引起其他系统的不良反应，研究发现其可致心脏Q-T 间期延长、尖端扭转型室性心律失常甚至猝死[3-5]。这使三氧化二砷在临床的应用受到限制。 已有三氧化二砷致不良反应的诸多研究，但其所致心脏毒性作用的确切机制尚不清楚。有研 究表明心肌细胞的凋亡参与了心肌梗死和心力衰竭的发生发展[6]。还有研究证明三氧化二 砷可以诱导某些肿瘤细胞系的凋亡[7,8]。所以，我们假设三氧化二砷所致的心脏毒性心肌细 胞凋亡起重要作用。本实验以H9c2 心肌细胞株研究三氧化二砷是否可以诱导H9c2 心肌细 胞凋亡并阐明其心脏毒性的作用机制。 1. 材料与方法 1.1 药品 DMEM 培养基、胎牛血清、其他细胞培养所需试剂均购自 Gibco(Grand Island, NY, USA) 。CaspACE assay system, fluorometric kit 购自Promega (WI,USA) 。乳酸脱氢酶试剂盒 为南京建成生物工程研究所。其他试剂均为Sigma 公司。 1.2 细胞培养及药物干预 H9c2心肌细胞株由加拿大蒙特利尔心脏研究所王治国教授馈赠。复苏后接种于25ml 培养瓶及铺有无菌盖玻片的6孔培养板，贴壁生长于DMEM 培养液(含10 %小牛血清及1%青 霉素及链霉素), 置37°C、5 % CO2 饱和湿度条件的培养箱中常规培养至90%,实验分组:空白 对照组以及不同浓度(2, 4, 8, 10µM )As O 作用24小时后的五个实验组。 2 3 1.3 细胞活力检测 用MTT 比色试验检测细胞活力。检测原理为活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能使外源性 3- （4 ，5-二甲基噻唑-2 ）-2，5-二苯基四氮嗅盐（简称MTT ）还原为难溶的蓝紫色结晶物。 由酶联免疫检测仪检测，波长490 nm 。 1.4 乳酸脱氢酶（LDH ）检测 1本课题得到黑龙江省科技计划（GC06C33302 ）；高等学校博士学科点专项科研基金（20060226019 ）的资 助。 - 1 - 细胞坏死释放LDH使培养液中LDH增高。使用LDH试剂盒检测。 1.5 荧光显微镜检查 AO/EB染色法检测凋亡。AO可透过完整细胞膜着色DNA ，呈绿色荧光。EB只能透过破 损的细胞膜着色DNA ，呈橙红色荧光。由此可以辨别正常、凋亡以及坏死细胞。细胞贴壁 生长于六孔板加入AO/EB溶液（100 µg/ml AO and 100 µg/ml EB in PBS）10 µl，荧光显微镜 观察(Eclipse TE300, Nikon)取五个不同区域低倍视野观察计数。 1.6 Caspase-3 活性测定 刮刀