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十六、致畸试验 Teratogenicity Test 范围 本规范规定了动物致畸试验的基本原则，要求和方法。 本规范用于检测化妆品原料的致畸性。 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No. 414, May 1981 ) 食品安全性毒理学评价程序（GB15193.14—94）。 试验目的 检测妊娠动物接触化妆品原料后引起胎鼠畸形的可能性。 定义 致畸性：能在胚胎发育期引起胎鼠永久性结构和功能异常的化学物质特性。 试验基本原则 在胚胎发育的器官形成期给妊娠动物染毒，在胎鼠出生前将妊娠动物处死，取出胎鼠检查其骨骼和内脏畸形。 试验方法 6.1 试剂 6.1.1 茜素红溶液：茜素红0.1g，氢氧化钾10g，蒸馏水1000mL。 6.1.2 透明液A：甘油200mL，氢氧化钾10g蒸馏水790mL. 6.1.3 透明液B：甘油与蒸馏水等量混合。 6.1.4 固定液（Bouins液）：苦味酸饱和液75份，甲醛20份，冰醋酸5份。 6.2 实验动物和饲养环境 动物选择：首选为健康的性成熟大鼠。 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。 6.3 剂量和分组：至少设三个剂量组，最高剂量应能引起母鼠某些毒性反应，但不应引起10%以上动物的死亡。最低剂量不会出现可观察到的毒性反应。另设阴性对照组。当初次进行致畸试验或使用新的动物种属和品系时，必须同时设阳性对照组，阳性对照物可选用敌枯双、维生素A等。 6.4 试验步骤 6.4.1 “孕鼠”的检出和给受试物时间：雌鼠和雄鼠按1：1（或2：1）同笼，每日晨观察阴栓（或阴道涂片），查出阴栓（或精子）的当天定为孕期零天。如果5 d内没查出“受精鼠“，应调换雌鼠。检出的‘受精鼠”按随机分组。在孕期6d~15d，每天经口给予受试物。孕鼠于孕期0、6、10、15和20 d 称重，并根据体重调整给受试物量。 6.4.2 孕鼠处死和一般检查：大鼠于妊娠第20 d 处死。剖腹检查卵巢内黄体数，取出子宫，称重；检查活胎、早期吸收和死胎数。 6.4.3 活胎鼠检查 逐一记录胎鼠体重、体长、尾长、检查胎鼠外观有无异常，如头部有无脑膨出、露脑、小头、小耳、小眼、无眼和睁眼、兔唇、下颌裂，躯干部有无腹壁裂、脐疝、脊柱弯曲，四肢有无小肢、短肢、并趾、多趾、无趾等畸形，尾部有无短尾、卷尾、无尾、肛门有无闭锁。 6.4.4 胎鼠骨标本的制作与检查 将每窝2/3的活胎鼠放入95%（V/V）乙醇中固定2周~3周，取出胎仔（或可去皮、去内脏及脂肪）流水冲洗数分钟后放入1g~2g/100mL的氢氧化钾溶液内（至少5倍于胎仔体积）8h~72h，透明后放入茜素红应用液中染色6h~48h，并轻摇1~2次/d，至头骨染红为宜。再放入透明液A中1d~2d，放入透明液B中2d~3d，待骨骼染红而软组织基本褪色，将标本放入小平皿中，用透射光源，在体视显微镜下作整体观察，然后逐步检查骨骼。测量囟门大小，矢状缝的宽度，头顶间骨及后头骨缺损情况，然后检查胸骨的数目，缺失或融合（胸骨为6个，骨化不全时首先缺第5胸骨、次为缺第2胸骨）。肋骨通常12~13对，常见畸形有融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中断。脊柱发育和椎体数目（颈椎7个，胸椎12~13个，腰椎5~6个，底椎4个，尾椎3~5个），有无融合、纵裂等。最后检查四肢骨。 6.4.5 胎鼠内脏检查 每窝的1/3胎鼠放入Bouins液中，固定两周后作内脏检查。先用自来水冲去固定液，将鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾，用刀片从头部到尾部逐段横切或纵切。按不同部位的断面观察器官的大小、形状和相对位置。 经口从舌与两口角向枕部横切（切面1），观察大脑、间脑、延髓、舌及颚裂。 在眼前面作垂直纵切（切面2），可见鼻部。 从头部垂直通过眼球中央作纵切（切面3）。 沿头部最大横位处穿过作横切（切面4）。 以上切面的目的可观察舌裂、颚裂、眼球畸形、脑和脑室异常。 (5) 沿下颚水平通过颈部中部作横切（切面5），可观察气管、食管和延脑或脊髓。 以后自腹中线剪开胸、腹腔，依次检查心、肺、横膈膜、肝、胃、肠等脏器的大小、位置，查毕将其摘除，再检查肾脏、输尿管、膀胱、子宫或睾丸位置及发育情况。然后将肾脏切开，观察有无肾盂积水与扩大。 6.5 统计方法及结果评定 各种率的检查用Ｘ2检验，孕鼠增重用方差分析或非参数统计，胎鼠身长、体重、窝平均活胎数用T检验。结果应能得出受试物是否有母体毒性和胚胎毒性、致畸性，最好能得出最小致畸剂量。 为比较不同有害物质的致畸强度，可计算致畸指数，以致畸指数10以下为不致畸，10~100为致畸，100以上为强致畸。为表示有害物对人体危害的大小，可计算致畸危害指数，如指数大于300说明受试物对