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十四、亚慢性经口毒性试验 Subchronic Oral Toxicity Test 1 范围 本规范规定了啮齿类动物亚慢性经口毒性试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料的亚慢性经口毒性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No. 408, May 1981 ) 3 试验目的 在估计和评价化妆品原料的毒性时，获得受试物急性毒性资料后，还需进行亚慢性经口毒性试验。通过该试验不仅可获得一定时期内反复接触受试物后引起的健康效应、受试物作用靶器官和受试物体内蓄积能力资料，并可估计接触的无有害作用水平，后者可用于选择和确定慢性试验的接触水平和初步计算人群接触的安全性水平。 4 定义 4.1 亚慢性经口毒性(Subchronic oral toxicity) 是指在实验动物部分生存期内，每日反复经口接触受试物后所引起的不良反应。 4.2 无有害作用水平（No-adverse-effect level ） 是指在试验中不引起任何有害作用的最大染毒剂量，可用每日单位动物体重接触受试物的重量（mg/kg）表示。当受试物是混入动物饲料或饮水中进行染毒时，可用每公斤饲料或每毫升饮水中受试物重量（mg/kg, mg/mL）表示。 5 试验的基本原则 以不同剂量受试物每日经口给予各组实验动物，连续染毒90d，每组采用一个染毒剂量。染毒期间每日观察动物的毒性反应。在染毒期间死亡的动物要进行尸检。染毒结束后所有存活的动物均要处死，并进行尸检以及适当的病理组织学检查。 6 试验方法 6.1 实验动物和饲养环境 6.1.1 动物种系的选择 常规选择啮齿类动物，首选大鼠。一般选用6周～8周龄的大鼠。动物体重的变动范围不应超出平均动物体重的10%。若该试验为慢性试验的预备试验，则在两个试验中所用的动物种系应当相同。 6.1.2 动物的性别和数量 　　每一剂量组实验动物至少应有20只（雌雄各半），但是考虑到亚慢性试验的重要性，应适当增加每组雌雄动物数。若计划在试验过程中处死动物，则应增加计划处死的动物数。试验结束时的动物数需达到能够有效评价受试物毒性作用的数量。此外，可另设一追踪观察组，选用20只动物（雌雄各半），给予最高剂量受试物，染毒90d，在全程染毒结束后继续观察一段时间（一般不少于28d），以了解毒性作用的持续性、可逆性或迟发毒作用。 6.1.3 饲养环境 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制。 6.2 剂量分组 试验时至少要设三个染毒组和一个对照组。除不接触受试物外，对照组的其它条件均与试验组相同。最高染毒剂量的设计应在引起中毒效应的前提下又不致造成动物过多死亡，否则将会影响结果的评价。低剂量组应不出现任何毒性作用。若掌握人群接触水平，则最低染毒剂量应高于人群的实际接触水平。中间剂量组应引起较轻的可观察到的毒性作用。若设多个中间剂量组，则各组的染毒剂量应引起不同程度毒性作用。在中、低剂量组和对照组中，动物死亡率应很低，以保证得到有意义的评价结论。 对那些毒性较低的物质来说，当通过饲料染毒时应特别注意确保大量的受试物混入不会对动物正常营养产生影响。对其它的染毒方式要加以特殊说明。若采用灌胃方式染毒，则每日染毒时点应相同，并定期（每周）按体重调整染毒剂量，维持单位体重染毒水平不变。 本项试验中，如果接触水平超过1000mg/kg时仍未产生可观测到的毒性效应，而且可以根据相关结构化合物预期受试物毒性时，可以考虑不必进行三个剂量水平的全面试验观察。 6.3 试验步骤 染毒开始前至少要有5d时间使实验动物适应实验室饲养环境。实验动物随机分组。受试物可通过混入饲料或饮水、直接喂饲以及灌胃进行染毒。动物最好每周7d染毒，但考虑到可行性，每周可染毒5d。试验期间所有动物染毒的方式应完全相同。若为染毒目的加入其它溶剂或添加剂，这些溶剂或添加剂不应影响受试物的吸收或引起毒性作用。 6.4 临床观察 　　观察时间应至少为90d。追踪观察组还要增加28d，但不作任何处理，以了解毒性作用的可逆性、持续性及迟发毒作用。 观察期间对动物的任何毒性表现均应记录，记录内容包括发生时间、程度和持续时间。观察应至少包括如下内容：皮肤和被毛的改变、眼和粘膜变化、呼吸、循环、植物神经和中枢神经系统、肢体运动和行为活动等改变。应计算每周饲料消耗量（或当通过饮水染毒时的饮水消耗量），记录每周体重变化。 6.5 临床检查 6.5.1 眼科检查 在动物染毒前和染毒后，最好对所有实验动物，至少应对最高剂量组和对照组动物，使用眼科镜或其它有关设备进行眼科检查。若发现动物有眼科变化则应对所