同位素标记方法-蛋白质组学【荐】.pptVIP

稳定同位素标记 稳定同位素标记 常见的同位素标记技术 代谢标记法—15N标记法 代谢标记法—SILAC 代谢标记法—SILAC 代谢标记法—SILAC Labelin corporation 代谢标记法—SILAC 化学标记法—ICAT 化学标记法—iTRAQ 化学标记法—iTRAQ 化学标记法—iTRAQ 常见同位素标记比较 * * 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 代谢标记法： 在培养基中添加15N或其他同位 素氨基酸（15C或2H)的氨基酸，细胞 经过若干代培养后，蛋白质将完全被 同位素标记，等量混合标记与没有标 记同位素的样本、液相色谱和SDS-PA GE的分离，然后进行质谱鉴定和定量。 化学标记法： 在收集蛋白质样品后，利用化学 反应在蛋白质或肽段的特殊位点引入 同位素标签，等量混合标记与没有标 记同位素的样本、液相色谱和SDS-PA GE的分离，然后进行质谱鉴定和定量。 代谢标记法： （1）15N标记法 （2）细胞培养中含有稳定同位素的氨基酸标记法（SILAC) 化学标记法： （1）ICAT法 （2）iTRAQ法 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 简介： 在培养基中添加15N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS分离，质谱鉴定和定量。 根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。 优点： 高效性：15N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%； 重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； 灵活性：在培养基中添加同位素标记15N ，操作方便。 缺点： （1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。 （2）由于使用的15N培养基纯度96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 简介： SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术，在细胞培养时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，细胞经传代培养若干代后，蛋白质将被同位素稳定标记，等量混合标记的蛋白质后分离和质谱鉴定，根据一级质谱图中三个同位素型肽段的面积比较进行相对定量和二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 随着细胞培养的传代，细胞种原有的”轻“型蛋白质逐渐被”重“型蛋白质蛋白质代替 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 技术优势——目前比较蛋白质组学最先进方法 （1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%； （2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； （3）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级水平； （4）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记； （5）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸，操作方便。 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 化学标记法—ICAT A: ICAT试剂结构，包括3个部分， SH反应集团， biotin标签，同位素臂， 试剂具有两种形式：重型（含8个氘） 和轻型（不含氘） B: ICAT标记定量技术流程，来源不同 处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和 轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合， 胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标 记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰 图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。 ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特异化的片段离子就会使串联质谱分析标