目的基因的克隆【荐】.pptVIP

A PCR法 B 基因文库的构建 C cDNA法 D 化学合成法 E 鸟枪法 DNA的鸟枪法测序的主要步骤 第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。 第二，高效、大规模的末端测序。 第三，序列集合。 第四，填补缺口。 透析袋电洗脱 ： 切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，DNA出胶后进行抽提DNA回收。 低熔点琼脂糖凝胶： 切下胶，加热到65℃熔化胶，然后抽提回收DNA。 方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。 玻璃珠洗脱法： 将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。 琼脂水解酶： 将含DNA的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA cDNA法克隆目的基因的局限性 并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感， 分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因 化学合成法的基本战略 化学合成的单元操作 DNA化学合成的用途 化学合成法的基本战略 全基因合成 化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略： 小片段粘接法： 混合退火 根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 化学合成法的基本战略 全基因合成 补钉延长法： 混合退火 根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本战略 全基因合成 大片段酶促法： 混合退火 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本战略 全基因合成 上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7% 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其 编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到 的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时 必须考虑下列问题： 生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间 探针内部不应出现可能的互补区域 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 某段连续的氨基酸序列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 所有可能的DNA序列 TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC 设计的简并探针序列 TGTATGGACGAIATGA TGTATGGATGAIATGA TGCATGGACGAIATGA TGCATGGATGAIATGA A G 此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计 expressed sequence tag 化学合成的单元操作 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的 DNA化学合成的用途 合成天然基因 修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素 如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 基因等 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆