分子生物学与细胞生物学实验基本技术2..docVIP

实验十九 SSCP技术检测基因突变 一、目的 学习分析基因突变的SSCP技术。 二、概述 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了 检测突变方法的简便性和灵敏性.仪通过PCR扩增制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制的胶液将梳子插入模子室温放置1h使之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TBE封闭，备用电泳 　10-15℃下电泳.开始在电泳，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染银染法 将用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定min，不断摇晃。 倒掉固定液，用去离子水洗二次再浸入0.15%AgNO3）中，染色10分钟。 倒掉染色液，用去离子水洗3--5次浸入5%NaOH和 0.%甲醛中显色min）。 立即倒掉显色液，加入终止液（10%冰乙酸），终止反应。. 将凝胶置无水乙醇中脱水，凝胶图象分析仪PCR-SSCP只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序。 由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。?3、经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现。 在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺(%) 1Kb～700b 3.5 700b～500b 5 500b～200b 8 200b 12 审 实验二十 PCR-RFLP 一、目的 掌握PCR-RFLP方法及其在基因突变检测中的应用 二、概述 PCR-RFLP技术:PCR-RFLP全称多聚酶链反应(PCR)一限制性片段长度多态性 (restriction fragment length Polymorphism，RFLP)分析.PCR-RFLP主要有三个环 节:(1)靶基因PCR扩增;(2)扩增的DNA片段限制性酶切图谱(长度多态性).该术应用PCR 将目的基因片段扩增百万倍以上，即使被测样品核酸量小于pg水平，也能被扩增出来，这不仅大大提高了基因分析的灵敏度，而且无需标记或放射性探针杂交过程.PCR-RFLP主要用于核酸变异性分析与比较，当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重排，使某种酶切位点增加，减少或消失，导致限制性酶切片段长度发生改变，就产生了限制性片段长度多态性，由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点，根据其识别序列的位置和数量，可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过核酸电泳，可将长度不等的DNA片分离而显出其长度多态性(片段的大小). PCR-RFLP用于基因分析具有分辩率高，重复性好，简便快速直观等优点，主要用于微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断，HLA分型及载脂蛋白基因的分析等. 三、材料及试剂 ALW261内切酶及反应buffer PCR产物样品 去离子水 eppendorf管及Tip头 PCR仪 标记笔、无粉手套等 四、操作步骤 设置20ul反应体系，在200ulEP管中加入： PCR产物样品 17.5 ul 10×buffer 2 ul ALW261 0.5 ul 充分混匀，离心20S。 置于PCR议上37℃反应过夜 用6×上样buffer上样电泳（1.5％琼脂糖凝胶） 凝胶成像及观察 审 实验二一 动物组织细胞的裂解与全细胞蛋白提取、浓度测定 一、目的 掌握动物细胞裂解释放细胞全蛋白及其浓度测定的方法及保存条件 二、概述 组织细胞在特定的物理化学条件下，释放部分或全部蛋白质，通过离心等步骤加以分离，即可获得蛋白质粗品。制备细胞裂解物是分离蛋白质的一个重要步骤，裂解细胞的方法取决于不同的实验目的与要求。Cell lysis buffer 1用于释放细胞浆蛋白，Cell lysis buffer 11用分离全细胞蛋白，本实验以Cell lysis buffer 11为细胞裂解液提取全细胞蛋白。根据