除虫菊愈伤组织的诱导和继代培养.pdfVIP

第 27 卷第 2 期 唐山师范学院学报 2005 年 3 月 Vol. 27 No.2 Journal of Tangshan Teachers College Mar. 2005 除虫菊愈伤组织的诱导与继代培养 李小六，李艳梅，陈 超，田立民 （唐山师范学院 生物科学技术系，河北 唐山 063000 ） 摘 要：诱导除虫菊愈伤组织，结果显示：除虫菊愈伤组织从第 8d 开始迅速生长，20d 达到最大生长量；并 对除虫菊愈伤组织继代培养条件进行了探讨。 关键词：除虫菊；愈伤组织诱导；继代培养 中图分类号：Q949.9 文献标识码：A 文章编号：1009-9115 （2005 ）02-0001-03 从除虫菊经提取和加工后获得的天然除虫菊酯农药，具有起效快、作用广谱、药物残留低、对人畜无 害等优点,是世界公认的。目前天然除虫菊酯主要从除虫菊干花中提取，[1] 由于近几年世界范围内除虫菊花 市场供应短缺，造成其市场价格上扬，难以满足市场需求。本文以除虫菊花蕾为材料，诱导愈伤组织，并 进行继代培养，并对愈伤组织细胞生长的优化条件作了探讨，目的是为用植物生物反应器建立大规模除虫 菊细胞培养体系，[2][3][4]大量生产除虫菊酯等杀虫成分，进而工厂化生产天然除虫菊酯杀虫剂。 1 材料和方法 1.1 材料 除虫菊（Pyrethrum Cinerariifolium ）未成熟花蕾。 1.2 方法 1.2.1 培养条件 初始诱导培养基为：MS+2 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 NAA+ 0.1 mg·L-1 6-BA+20 g·L-1 蔗糖，琼脂 5 g·L-1 。 继代培养基为：MS+2 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 NAA+ 0.1 mg·L-1 6-BA+20 g·L-1 蔗糖，琼脂 5 g·L-1 ，pH 为 -1 5.8，培养温度为25～27 ℃，光照强度为2 000～2 500lx ，光照时间 12h·d 。 1.2.2 诱导方法 取除虫菊（Pyrethrum Cinerariifolium ）未成熟花蕾，于4 ℃下处理 24 h ，70%乙醇消毒30 s，再转入 0.1 ％HgCl2 溶液中消毒 5 min，无菌水冲洗 3～4 次，剥去花萼后接种于初始诱导培养基。 1.2.3 继代培养 （1）继代接种方法 选取典型活性的愈伤组织，在无菌条件下称取 0.1g，用镊子接种于 100ml 的三 角瓶固体培养基上，均分为 7～10 块，轻轻按压，使愈伤组织和培养基充分接触。 （2 ）细胞生长量测定 采用细胞鲜重法，将收获的愈伤组织称重得鲜重（DW ），减去接种量 0.1g， 即得愈伤组织总生长量。测定细胞生长曲线，一次性接种 150 瓶，从第二天开始，每次随机取 10 瓶，每 2 [2] 天测定一次除虫菊愈伤组织总细胞生长量，进行除虫菊愈伤组织生长曲线的测定（测定到第 30d ）。 （3 ）继代培养基的优化 在我们以往工作的基础上，对 2,4-D、NAA 、6-BA、蔗糖4 个因素 3 个水平 进行正交试验，[5]正交实验的因素水平表见表 1。 1