海洋真菌#K26的代谢产物研究.doc

海洋真菌#K26的代谢产物研究 赵丽冰，林永成* 中山大学化学与化学工程学院，海洋天然有机物研究室，广州，510275 摘要 本文研究了采自南海的海洋真菌#K26，从其菌体和培养物中分离得到8个单体化 化合物。经1HNMR、13CNMR、2DNMR、FABMS 等分析鉴定为胆碱硫酸酯（A），3,4,5－三 羟基苯甲酸（B）K26的代谢产物中，胆碱硫酸酯为首次从南中国海海洋真菌中分离得到；3,4,5-三羟基苯甲酸K26中胆碱硫酸酯及甘露醇均有较高的含量，如果对其培养条件进行更深入的研究，可将#K26开发为一种资源菌。胆碱硫酸酯（COS） 广泛存在于自然界中，它在土壤中硫的微生物转换方面扮演重要的角色[1,2]。多种植物、土壤真菌以及细菌都能利用胆碱和P A（3’-phosphoadenosine-5’-phosphosulphate）作为底物，在硫转换酶催化作用下合成COS[3,4－8]，另一方面在胆碱硫酸酯水解酶的作用下COS可发生水解，成为生物体内胆碱和硫酸基团的来源之一[1]。COS的另一个重要角色是作为抗渗透化合物。3,4,5-三羟基苯甲酸（即没食子酸）是一种多酚类化合物，由于分子中有一定量的R·OH基，能形成有抗氧化作用的氢自由基（H·），有超氧阴离子（O2-·）和羟基自由基（OH·）等自由基的活性，从而保护组织免受氧化作用的损害，以及提高免疫功能、抗癌、抗衰老等作用。 2 实验 2.1 仪器与试剂 所用试剂均为市售AR试剂。实验仪器包括INOVA -500核磁共振仪，VG ZAB-HS质谱仪，Nicolet 5DX傅立叶变换红外波谱仪，德国Elementar Vario EL元素分析仪，北京X4型显微熔点仪，S-520/Link ISIS-300扫描电镜/X-射线能谱联用仪。 2.2 培养及分离 真菌#K26菌种由中山大学生命科学院周世宁教授提供，并保存在中山大学生命科学院以及中山大学化工学院天然实验室内。菌种以PDA为培养基，4℃下保存。发酵培养基：葡萄糖1%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.1%，粗海盐0.3%和自来水，pH值等于7.0，共培养200L，分装于500ml三角瓶中，每瓶装培养基200～300ml，1.25 ×105Pa，灭菌30分钟，冷却后无菌条件下接种，在室温下静置培养28天。 将菌体与培养液分开收集，菌体风干后，用甲醇提取数次，发酵液浓缩后用等量的乙酸乙酯提取数次。提取液浓缩后，经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集各组分再反复经硅胶柱层析。 结果与讨论 3.1 化合物结构的确定 化合物A根据1HNMR可知分子中含有三组质子，化学位移分别为3.24（9H，s），3.77 （2H，t，J＝4.5Hz）和4.51 （2H，m，J=4.0，2.0Hz）。从13CNMR可知分子中有三种碳原子，化学位移分别是54.4，62.4 和65.2 ， DEPT分析得知分别对应于CH3、CH2和CH2，分子中没有次甲基碳（CH）和季碳（C）。综合1HNMR和13CNMR数据得知分子中含有3个化学环境完全相同的甲基－CH3和两个化学环境不同的亚甲基－CH2，且两个亚甲基相互关联（它们裂分的偶合常数相近），即分子中存在结构片断CH2-CH2。元素分析及X-射线能谱测定结果表明，分子中除含有C、H、N、S和O元素外，没有其它元素（如卤素等），C、H、N、S和O的含量分别为32.41％、6.94％、7.38％、16.80％和36.47％。FABMS显示分子离子峰是184 [M+1]+，表明分子中含有奇数N，由此可以推出化合物A的分子式为C5H13O4NS （ M=183 ）。综合以上分析，并通过文献查证[31]，确定化合物A是胆碱硫酸酯（Choline-O-Sulphate，COS）。体外细胞毒素试验表明，它对人的DNA拓朴异构酶I（hTOP I）没有抑制作用，IC50＞100μg/ml。 表1 化合物A的NMR数据（D2O，TMS） No. 13C 1H 1H-1HCOSY HMQC HMBC 1 2 3 62.4(CH2) 65.29(CH2) 54.4(CH3) 4.15(m,4.0,2.0Hz) 3.77(t,4.5Hz) 3.24(s) H-2,3 H-1 H-1 H-1 H-2 H-3 H-3 H-2 化合物B 从 1HNMR知道分子中含有5种氢，化学位移分别是2.88（2H，brs） 图1 化合物A ，B，C，D，E，F，G，H的结构式 化合物F ，氢谱中δ8.13（1H，brs）和δ8.12（1H，brs），以及δ3.87（1H，m）和δ3.77（1H，m）的氢信号为典型的环肽中环上NH和CH氢吸收信号，碳谱中δ171.5和δ1