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第二章 微生物菌种选育 Contents 第一节 菌种的来源 细菌 酵母菌 霉菌 二、工业微生物来源 三、微生物菌种的选择性分离 微生物样品的富集培养 目的菌种的分离 目的菌的筛选 四、重要工业微生物菌种的分离 筛选菌株的一些重要指标： （1）菌的营养特征 （2）菌的生长温度 （3）菌对所采用的设备和生产过程的适应性 （4）菌的稳定性 （5）菌的产物得率和产物在培养液中的浓度 （6）容易从培养液中回收产物。 抗生素产生菌的筛选 抑菌圈法 产生药理活性化合物菌株的筛选 第二节 发酵高产菌种的选育 菌种改良 一、自然选育 诱变育种 诱变育种的原理 超净工作台 诱变育种的一般步骤 诱变育种步骤 (一)出发菌株的选择 1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。 2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。 3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。 4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。 5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 (二)处理菌悬液的制备 这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。 (三)诱变处理 根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。 (四) 突变菌株的筛选 筛选分初筛和复筛。 初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。 1) 营养缺陷型的选育 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。 与营养缺陷型对应的是野生型。 与筛选营养缺陷型有关的三类培养基： ①基本培养基（MM，minimal medium）——能满足某一菌种的野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 ②补充培养基（SM，supplemental medium）——在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基。 ③完全培养基（CM，complete medium）——可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。 筛选营养缺陷型的步骤 诱变 淘汰野生型 检出缺陷型 确定生长谱 一、诱变方法 物理诱变 化学诱变 二、淘汰野生型 抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。 菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。 三、检出缺陷型 原理：利用不同菌株在固体基本培养基（MM）和完全培养基（CM）上，生长情况完全不同的特点。缺陷型菌株在CM上生长良好，而在MM上则不生长，而野生型都能生长。 具体方法：影印法、点种法、夹层法 (一)影印法 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。 (二)点种法 也就是任意法。 用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。 此法结果明确，但工作量大。 (三)夹层法 先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。 此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。 四、营养缺陷型的鉴定 验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。 （1）氨基酸、维生素、核酸碱基三大类营养缺陷的鉴定 （2）单一氨基酸营养缺陷的确定 将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。—个平皿测一个菌。 2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株的筛选 在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。 那些对类似物不敏感的突变体，则由于原来受反馈控制的