第十一章微生物与基因工程.pptVIP

第十一章 微生物与基因工程;第一节 基因工程的诞生 第二节 目的基因的分离 第三节 微生物与克隆载体 第四节 微生物与基因工程工具酶;基因工程诞生于1973年，在现代分子生物学领域理论上的三大发现及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用。;一 理论上的三大发现;1944年，Avery等从分子水平上研究证实转化因子是DNA。;（2）50年代搞清 楚了DNA的 双螺旋结构 和半保留复 制机理。;1953年，Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型。对生命科学的发展，足以和达尔文学说、盂德尔定律相提并论。 ;哈佛大学生物系教授Matthew Meselson和他的学生Franklin Stahl用实验证明了DNA是按半保留方式 进行复制的。;（3）60年代确定了遗传信息的传递方式。 确定遗传信息是以密码方式传递的，每三个核苷酸 组成一个密码子，代表一个氨基酸。 1966年，破译了64个密码子，编排了一本密码字 典，叙述了中心法则。从此，千百年来神秘的遗传现 象，在分子水平上得到了揭示。 ;二 技术上的三大发明;从40年代到60年代，虽然从理论上已经确立了基因工程的可能性，科学家们也为基因工程设计了一幅美好的蓝图。但是，科学家们面对着庞大的dsDNA，尤其是真核生物，其DNA分子是相当巨大的，仍然是束手无策，不能把它切成单个的基因片段。;1970年，流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind III。 1972年Boyer实验室又发现了名叫EcoR I的核酸内切酶。;;1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。这种酶能够参与DNA缺口的修复。1970年，美国的Khorana实验室发现了一种叫T4 DNA连接酶，具有更高的连接活性。 ;科学家有了对DNA切割与连接的工具，还不能完成DNA体外重组的工作。因为大多数DNA片段不具备自我复制的能力。所以，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，必须将DNA片段连接到一种特定的、具有自我复制的DNA分子上。这种DNA分子就是基因工程载体(Vector)。 ;1946，Lederberg开始研究细菌的性因子(F因子)，经过50和60年代，相继发现其它质粒，如抗药性因子(R因子)，大肠杆菌素因子(CoE)。;1972年，美国斯坦福大学的P.Berg领导??研究小组，在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组。 他们使用限制性内切酶EcoRI，在体外对猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌体的DNA分别进行酶切，然后再用T4DNA连接酶把两种酶切的DNA片段连接起来，结果获得了包含有SV40和λDNA重组的杂种DNA分子。（基因工程的雏形） ;1973，Cohen将质粒作为基因工程的载体使用。 具备了以上的理论与技术基础，基因工程诞生的条件已经成熟。 两位科学的“助产士’——Berg和Cohen把基因工程接到了人间。 基因工程诞生的元年。 ;In 1973, H.Boyer S.Cohen, 1st use of plasmid to clone DNA;;1.目的基因分离或合成 2.通过体外重组将基因插入载体 3.将重组DNA导入细胞 4.扩增克隆的基因 5.筛选重组体克隆 6.对克隆的基因进行鉴定和测序 7.控制外源基因的表达 8.得到基因产物或转基因动物、转基因植物;;四 微生物与基因工程的关系;第二节 目的基因的分离;一 基因文库分离目的基因;基因文库构建包括以下基本程序：;基因文库的类别; 基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA切割成一 定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。 cDNA文库是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经 反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克 隆的集合。;cDNA文库只反映mRNA的分子结构。cDNA中不含 有真核基因的间隔序列及调控区，确切说cDNA并不是真正意义上的基因;二 基因的化学合成;;寡核苷酸化学合成的实际用途;三 PCR扩增基因;四 基因的定位诱变;核心：创造点突变，或小片段的缺失和插入。;;第三节 微生物与克隆载体;质粒载体;　;;2 质粒载体的基本条件;pBR322质粒载体;pUC系列的质粒载体;pUC系列的质粒载体，包括如下四个组成部分：;EcoRI;pUC系列质粒载体的优点;pGEM系列载体; pGEM系列载体与pUC系列之间主要差别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动