电转法将DNA导入哺乳动物细胞核中.doc

电转法将DNA导入哺乳动物细胞核中 一、实验目的 掌握Nucleofection(TM)法转染细胞 二、实验原理 Nucleofection(TM)电转染技术是德国Amaxa导入真核细胞的转染方法。有利于促进外源DNA靶细胞。 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）由283个氨基酸残基组成，最早从华盛顿星期五港水域的维多利亚水母体内克隆得到。后来三、实验仪器、材料和试剂 (一)仪器、用具：电转仪、电击杯、C2培养箱、35mm细胞培养平板、微量移液器、烧杯、量筒等。 (二)材料：呈指数生长的真核细胞HepG2，可以表达绿色荧光蛋白（GFP）的真核表达质粒。(三)试剂1)完全培养液： DMEM 90ml 胎牛血清 10ml 2) 电转液： Solution Ⅰ10ml）： 2g ATP-Disodium salt （ATP-二钠盐） 1.2g MgCl2 6H2O0.2um 滤器过滤除菌，-20℃保存SolutionⅡ（500ml）： 6g KH2PO4 0.6g NaHCO3 0.2g 葡萄糖 用NaOH调节pH值到7.4。0.2um滤器过滤除菌，-20℃保存使用前将80ul solutionⅠ和4ml solution Ⅱ混合，在4℃可以存放一个月。 3）PBS 800ml水中溶解 8g NaCl； 0.2g KCl； 1.44g Na2HPO4， 0.24g KH2PO4，用浓HCl调pH值至7.4，定容1000ml，存于室温。 四、方法与步骤 1 在培养瓶中培养细胞密度达到70%-80%融合将电转液预热至室温。 向35 mm孔板中加入ml按比例混合的培养基与血清并置于37℃培养箱。 取培养的细胞，弃去培养瓶中的培养基，收集细胞。 取细胞悬液进行细胞计数。 1×106cell，200g离心10min弃上清。 用100ul电转液重悬细胞。 向电转液中加入5ug质粒DNA。 将混合液移至电杯中。 将电杯置于电转仪中，选择程序进行电转。 电转结束后，立即将混合液取出并加入到事先准备好的6孔板中、置于37℃培养。 24小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。、注意事项 1．整个转染过程中需要保持无菌操作。2．电转之前细胞最好传代4-5，传代20次的HepG2不宜做电转。细胞密度达到70%-80%融合时宜做电转，密度太高会导致转染效率降低。．。 六、作业 观察荧光显微镜下成功转染的细胞，计算转染效率。 绿色荧光蛋白/celldatabase/在这里找到自己的细胞名称，点击进入（注：需要注册），即可找到细胞所对应的程序（注：非96-well Shuttle System，而是Nucleofector），程序后的字母V、L、T、C、R即为所需的转染试剂盒型号。 2、开机设置程序： 打开桔黄色的主电源开关，等机器自检完毕并显示“Free Program Choice”，按X键进入；如未显示，则重复按menu键直到出现“Free Program Choice”，按go键进入。按《 键选择设置程序的英文部分，按上下键选择对应的字母；按 》键选择数字部分，上下键选择程序对应的数字，按X键确认程序。 3、进行转染： 在转染杯中加好样后放入仪器，点击X键，仪器自动进行电击转染。 二、仪器使用注意事项： 1、任何人等不得随意乱调仪器程序，影响大家使用； 2、请爱护仪器，使用完毕后请及时清理仪器，擦拭干净，不得使用带腐蚀性的试剂接触仪器，切记用完后拔下仪器电源； 3、使用该仪器时如果还有什么问题，请询问320室实验员侯敬尧； 4、任何人在使用仪器前请先去320室进行登记，领取试剂及电击杯等。 附2： 本实验所需药品 ATP-Disodium salt （ATP-二钠盐）MgCl2 6H2O、KH2PO4、 NaHCO3、葡萄糖、NaCl、 KCl、 Na2HPO4、 KH2PO4。