生物化学与分子生物学实验课讲义.docVIP

实验一 SDS碱裂解法小量制备质粒 一、实验目的 1．掌握SDS碱裂解法小量制备质粒的原理和方法。 2．掌握高速离心机、微量移液器等常规仪器的正确使用。 二、实验原理 对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体，用含一定浓度葡萄糖的缓冲液悬浮菌体，采用碱性SDS裂解细菌的细胞壁，使质粒缓和释放出来。同时整个溶液的pH为12-12.5，使断裂成线性细菌染色体DNA变成单链、相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上，当液体的pH调至中性并有高浓度存在下，大部分蛋白质和细菌染色体形成沉淀，而共价闭环质粒DNA仍为可溶状态，离心获得含有大量质粒上清液，用RNA酶A处理除去RNA，用苯酚氯仿除去残留蛋白质，再利用核酸不溶于有机溶剂的性质，从而使其在适当浓度的亲水性有机溶剂中（乙醇、异丙醇、PEG8000）沉淀析出。 三、材料、试剂和仪器 1．试剂 GT116（含psiRNA质粒）菌种 LB液体培养基 溶液 I、溶液 II、溶液 III、无水乙醇、氯仿、异戊醇、Tris饱和酚、RNA酶A、TE、STE、卡那霉素（配方见附录） 2．仪器和材料 超净台、高速离心机、微量移液器、灭菌eppendorf管和tips、37℃摇床、旋涡混匀器 四、实验操作步骤 在超净台内从平板上挑取单菌落或用以其它方式保存的菌种接种于3ml LB培养基，在37℃培养15-18个小时。 向1 个2ml的离心管里加约1.5ml的菌液。不要把菌液溅出造成污染。 10000 rpm离心2分钟。注意离心机上放置的管重力要平衡，保护离心机。 弃上清液于废液瓶中。 重复离心一次，尽量弃去上清。 加入100ul冰冷的溶液I，然后剧烈振荡混匀，置冰上。 加入200ul溶液II，轻柔混匀，置冰上4分钟。 加入150ul冰冷的溶液III，轻柔混匀，置冰上5分钟。 12000 rpm离心5分钟。把上清液转移到另一1.5ml离心管中（约450ul）。 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混合液，剧烈振荡，12000 rpm离心2分钟，小心的收取上层溶液（约450ul）于另一1.5ml离心管中。 加入等体积氯仿：异戊醇，剧烈振荡，12000 rpm离心2分钟，小心的收取上层溶液（约400ul）于另一1.5ml离心管中。 2倍体积（800ul）－20℃预冷的无水乙醇，置冰上10分钟，沉淀质粒DNA。 12000 rpm离心5分钟，弃上清 用1ml 冰预冷的70％的乙醇洗沉淀，轻轻转动离心管， 12000rpm离心1分钟，弃上清液。 室温干燥沉淀。加入50ul TE（含20ug/ml RNA酶A）溶解质粒， -20℃保存。 五、质粒相关知识 质粒是细胞染色外一种双链环状DNA分子，它随寄主细胞稳定遗传。对于质粒的研究始于1946年，美国科学家Lederberg.J.首先研究了细菌的性因子（F因子），随后科学家们又相继发现了细菌的抗药性因子（R因子），大肠杆菌素因子（CoE）等，并对这些染色体外遗传单位的性质、功能及与宿主的关系进行了的深入的研究，为建立第一批重组DNA载体提供了科学的材料。 质粒DNA在细菌中的复制分为严紧型（stringent control）和松弛型（relaxed control）。严紧型质粒的复制要在蛋白合成时和DNA聚合酶的III存在，只随染色体的复制而复制，其拷贝数少，每个细胞中只有1-10个；松弛型质粒的复制需要使用的是DNA聚合酶Ⅰ，它在细胞生长周期中随时可以复制，每个细胞中有10-200以上个拷贝。为了便于基因克隆，作为载体的质粒特点如下： 是一个复制子，能自我复制。使它携带的目的基因得到大量扩增。 分子量小（相对分子质量一般在106-107），拷贝数要高，便于应用（如便于提取、基因克隆、酶切鉴定、细胞转化、原位杂交等）。 至少要有两个便于选择的遗传标记，其一用于检查外源DNA是否插入到质粒中，例如载体中引入的LacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个146个氨基酸的α-肽，可以被IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导合成，新合成的肽能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，该酶能够水解X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚，使含X-gal的培养基中生长的菌落为蓝色。若有外源DNA插入LacZ中，因不能合成正确的α-肽，转化或转染的Lac缺陷菌株，用X-gal筛选，含阳性无隆载体的菌落为白色，含空载体的菌落为蓝色；其二用于选择已把载体转化到细菌中的菌落，如氨苄青霉素抗性基因（Ampr），只有已转化含有质粒的重组菌在Amp培养基中才能生长。 有多个单一的酶切位点，起点在某个遗传标记上，便于基因克隆，鉴定。 提取的质粒多数以超螺旋型存在，超螺旋的DNA中一个螺旋