农学院+蛋白质组学的研究平台+实验指南.pdfVIP

北京农学院 蛋白质组学研究平台 实验指南 平台负责人 花宝光 教授 编写 胡昊 王一鸣 2007 年 12 月 第一版 为了您的实验能够高效准确的完成，请事先阅读以下 提示 1. 关于本平台的实验许可请事先咨询花宝光教授， 实验室工作人员无权决定。 2. 因实验涉及贵重仪器，恕不外借任何仪器。 3. 因本平台运营成本有限，恕不提供任何试剂与耗 材，请实验者自备。 4. 因本平台实验进程紧张，正式实验前请务必咨询 工作人员，以尽早安排实验计划，减少等待时间。 5. 本实验指南仅适用于一般性实验，包括植物、动 物的常规样品，可能不适用特殊物种或特殊器官 组织。因实验室工作人员精力有限，请自行查阅 相关文献以优化实验方法。请谅解！ 目录 1 样品制备（TCA/Acetone 法） 2 样品裂解 3 蛋白定量（Bradford 法） 4 等电聚焦 5 胶条平衡 6 SDS 7 染色 1 样品制备（TCA/Acetone 法） 1.1 试剂配制 1.1.1 提取液 I 三氯乙酸 10%（w/v），β-巯基乙醇 0.07%（v/v），丙 酮定容。 1.1.2 提取液 II β-巯基乙醇 0.07%（v/v），丙酮定容。 1.2 实验方法 （1）取 2g 样品，加入 0.2g PVP-40，液氮研磨，转 入离心管中。 （2）加入 6 ml 提取液 I，混匀，-20℃降解 1h。 （3）15000 rpm，4℃，离心 15 min。 （4）弃上清，加入 6 ml 提取液 II，混匀，-20℃降 解 1h。 （5）15000 rpm，4℃，离心 15 min。 （6）重复（4）-（5） （7） 弃上清，冷冻抽干后，-80℃保存。 2 样品裂解 2.1 试剂配制 2.1.1 裂解液 尿素 7 M 10.5 g 硫脲 2 M 3.8 g CHAPS 4% (w/v) 1.0 g 两性电解质 　 2% (v/v) 500 μl DTT 40 mM 0.154 g 加水定容至 25 ml 分装为 1ml,-20℃保存。 2.1.2 水化上样液 尿素 7 M 10.5 g 硫脲 2 M 3.8 g CHAPS 2% (w/v) 0.5 g 两性电解质 0.5% (v/v) 　 125 μl 1%溴酚蓝 0.002% 50 μl 定容至 25 ml 分装为1ml,-20℃保存。 使用前，每1ml中加入0.0028g DTT。 2.1.3 1%溴酚蓝 溴酚蓝 1% 100 mg Tris 50 mM 0.06 mg 定容至 10 ml 2.2 实验方法 （1）称取0.01g样品，溶于400μl裂解液中。 （2）37℃温育30min，其间摇匀2次。 （3）13000rpm，常温离心45 min。 （4）抽取上清液转移至另一离心管中。 （5）13000rpm，常温离心45 min，抽取上清液。 （6）按第3章方法进行蛋白定量。 （7）依胶条规格与所需染色方法，推荐按下列方法 上样* 。   IPG 胶条长度  上样终体积  银染色蛋白质上样量  考马斯亮蓝染色蛋白质上样量  7 cm  125 μL  80 μg