抗肝癌人源性噬菌体Fab抗体库的构建与筛选.pdfVIP

216 中国癌症研究进展。 抗肝癌人源性噬菌体Fab抗体库的构建和筛选 于继云刘彦仿粱米芳张素珍赵君张静 马兰花王小平师娟子李唯薛颖 噬菌体抗体库技术的发展为人源性抗体的制备提供了新的途径。该技术用逆转录PCR 方法，把全套抗体的可变区基因扩增出来，重组到原核表达载体中，并通过与单链噬菌体外壳 蛋白pill的融合，把Fab或单链抗体表达在噬菌体的表面，形成噬菌体抗体库。然后用亲和 层析的原理，通过重复“吸附，洗脱．扩增”过程，可从容量为10s以上的抗体库中将特异性抗体 筛选出来。但与制备抗病毒抗体相比，筛选抗肿瘤抗体明显困难。为了获得特异性抗肿瘤抗 体，构建高质量的抗体库是其首要条件。我们将人杂交瘤技术中的体外免疫技术引入噬菌体 抗体库技术中，构建了“免疫的”人源性噬菌体抗体库，并从构建的抗体库中，筛选到了两株能 够与肝癌细胞结合而不与正常肝细胞结合的噬菌体抗体。 材料与方法 I一)质粒、菌株、细胞 表达载体为pComb3(40 PelB前导序列，以完成抗体分子片段的分泌性表达，Fb段3’与噬菌体外壳蛋白Ⅲ编码基因的 第198位至406位氨基酸编码序列相连，Fd和轻链基因的克隆位点分别为XhoI和 I十Spe 人肝癌细胞株SMM07721由本实验室保存。 (二)体外免疫方案【l·2】 mol／L 至对数生长期时用0．25％胰酶消化下来，用4℃预冷的0．01PBS(pH7．4)洗一遍，然后 用冷丙酮一甲醇(1：1)将细胞固定10 养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为1×106／ml，分装小管，一40℃冻存。另外也用放射线照 000 射法制备细胞抗原。培养至对数生长期的肝癌细胞用2 rad剂量的60Co照射，用无血清 RPMI一1640培养基洗一遍后重悬细胞，调整细胞浓度为1×lOs／ml。临用时新鲜制备。 2．条件培养液的制备分离正常人外周血淋巴细胞，调整细胞浓度至2×106／ml，用含 h后离心收集上清，分装小 10％人AB血清的RPMI．1640培养基(加PHA5“g／rrd)培养48 份。一20℃保存力备用。 作者单位：710032西安，第四军医大学病理学教研室(于继云刘彦仿张素珍赵君张静马兰花 王小平师娟子)；中国预防医学科学院病毒学研究所出血热室(梁米芳李唯薛颖) 抗肝癌人辣性噬菌体F8b抗体库的构建和筛选 217 3．患者淋巴细胞的分离和培养淋巴细胞分别来源于13例肝癌患者外周血及1倒外科 ma)至终浓度分别为5ttg／ml、10 后冻存的细胞抗原或新鲜制备的60Co照射后的细胞抗原，使肝癌细胞与淋巴细胞的比例为 浓度提高到25％，其余条件不变。共培养7d，观察淋巴细胞生长及形态学变化。 (三J人源IgGFab段基匿的PCR扩增 - 收集培养的淋巴细胞，用TRIzol go-dTl5将提取的RNA通过逆转录酶(美国Gibco，B王也)逆转录合成cDNA。 54℃1min，72℃2min，35个循环后，72℃延伸10min。 · (四)轻链基因的克隆 左右，PCR产物用量每次1螺左右。酶切反应后进行电泳，并用SNn-X柱回收纯化酶切片 段。 取上述酶切纯化的载体DNA 1．5～2腭，轻链混合物0．5tg，加高浓度连接酶(美国Gi． boc，BIu)连接。连接产物经乙醇沉淀后，用10m去离子水重悬，用电转化法导人事先制备好 的200 ul电转感受态菌XLI—Blu(电转条件为：Bio-Red电转仪，0．2clqa电转杯，2．5kV)，电转 ml 后加5 37℃预热的sOC培养基，37℃1 (10