第二章 基因工程的主要技术原理-3.pptVIP

用大引物PCR法获得突变体 Beg1: 5’ GGG,GTC,GAC,GGC,TAT,AAA,ATG,GCT,T 3′ Beg2: 5’ A, TTA,AAT,CTG,ATC,AAA, TCG, AAT,CC 3′ End2: 5’ ATC, AAG, CTT, GGT,CAC,ATC,CTC,AAT 3′ * 引物重叠区扩增法 将Oligo ①~④用双蒸水稀释到10 μmol/L, 分别取Oligo ①~ ④ 5 μL、0.2 μL、0.2 μL、5 μL, 25 mmol/L Mg2+ 8 μL, 10 mmol/L dNTP 1.6 μL, 10×PCR buffer 10 μL, Taq 5 U, 加水到100 μL, 进行PCR。 PCR循环为94 5℃ min, (94 30℃ s, 58 30℃ s, 72 ℃30 s) × 10, (94 30℃ s, 50 ℃30 s, 72 30℃ s) × 20, 72 10℃ min, Beg1 End2 Beg2 130bp 95 ℃预变性3 min后开始PCR 循环,条件为94 ℃40 s ,55 ℃40 s ,72 ℃40 s , 共30 次, 最后72 ℃延伸7 min。经回收、纯化,琼脂糖电泳定量后,取约200ng 作为3’端的大引物与Beg1 配对,再次以pGkuVP4 为模板进行PCR. 2400 bp A1 B2 A2 B1 分别以A1和A2, B1和B2进行第一轮PCR扩增; 然后以第一轮的产物作为大引物进行第二轮PCR扩增, 此时不加模板. *