Lfy+cDNA高效单子叶植物表达栽体的构建及其转化兰花的研究初报.pdfVIP

堍j印§溶商效单子时植物表达载体的构建 及转化兰花研究初报 邵寒霜1 李继红1王胜培2 1中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室海口57n01 哗南热带农业大学农学院热作系儋州571513 提要构建了一个适合在单子叶植物中高效表达的含有I母c蜊A的表达载体(pBⅢ一 1)，应用基因枪转化法将其导人兰花原球茎中，获得了一些卡那霉素抗性克隆。 热带兰的研究、繁殖、栽培、销售，已成为世界经济的重要组成部分之一。海南属热带地区， 有其独特的地理优势和透宜的气候条件，是培育兰花的天然基地。但热带兰工业化生产周期 长，成本高，不易管理，需花费大量的人力、物力．对生产十分不利：1我们试图将嘶基因转入兰 花以期获得提早开花的转基因植株，本文报道构建了以uBI为启动子的I爵cDNA高效单子叶植 物表达载体及转化兰花的初步结果。 关键词mcDNA单子叶植物表达载体 构建 兰花 转化 1材料和方法 1．1供试质粒和菌种 阿f—B由作者构建。 1．2植物材料 文心兰(‰谢洳1)由农学院热作系王胜培副教授提供。 1．3试剂和酶 实验中所用的工具酶均购自PⅢ孕公司，其它生化试剂均国产。 1．4 I卸eDNA单子时植．物表达载体的构建 1．4．1质拉nAHCl8酶切位点的鉴定 位点。 1．4．2中间栽体pBGU构建 用H瑚Ⅲ+EcoRI消化曲Hcl8，然后进行琼脂糖凝胶电脉，回收包含uBI启动子全长 I 酶切鉴定。 1．4．3中间载体pBanf的构建 质粒pGⅡ一p用s日lI彻底消化，补平后sacI酶切并用低熔点琼脂糖凝胶回收分子量约为 起，阳性重组子用)amI+S”I酶切鉴定。 1．4．4表达戢体pB皿～1的构建 I+陆RI酶 Nost的载体片段。二者的连接反应在16℃下进行4小时，阳性重组子用splI 切鉴定。 1．5基因枪转化兰花 1．5．1质粒DNA的提取 r‘1 供试质粒pBm一1用碱裂法进行大量抽提，方法参见文献：|纯化后将质粒DNA稀释至 l腭乍1，并在一20℃保存。 1．5．2兰花原球茎对卡那霉素，G418的敏感性 统计结果。 1．5．3金粉的制备 (1)金粉处理 _ 清，该步骤重复三次。加50％甘油lO阻l至终浓度60叫d(可在4℃或室温下保存两星 期)。 (2)质粒DNA包被金粉的制备 2．5M 10[扯1甘洫贮备液混匀5分钟，加入l舡l质粒DNA(1鸬印1)、l吣tlc丑c12。4嗥l 用70％乙醇，100％乙醇各清洗2次。可供10枪使用。 1．5．4基因枪转化 本研究使用Bio—Rad 茎，轰击后原球茎在繁殖培养基上恢复O、2、4、6、8、10天后转入抗性培养基上。 1．5．5抗G418原球茎的筛选及抗性小植株再生 转化后的原球茎转入40叫LG418的选择培养基中，每15 将绿色部分转入新的选择培养基中继续筛选，四到五次继代后， 分化培养基中。 547 ◆ 2结果与分析 1 2 3 4 5 e 7 图l质粒pm{c18酶切电泳结果 I加N^／}ⅡndⅢ十B∞RI标准分子量 2．pAHct8用E∞RI+B蛐双酶切 图3重组质粒pB皿一l酶卸电球 3．pAHcl8用E。oRI+Hi柚m