chap15(补充)酶类药物.pptVIP

第十五章 酶类药物 第一节 酶类药物的原料来源 一、原料选择 （1）不同酶的用料选择 乙酰化酶（鸽肝）、凝血酶(牛血）、透明质酸酶（羊睾丸）、溶菌酶（鸡蛋清），超氧化物歧化酶（血、肝） （2）注意不同生长发育情况及营养状况 （3）原料来源丰富 （4）从简化提纯步骤着手 （5）如用动物组织作原料，应在此动物宰杀后立即取材。 酶类药物 二、微生物酶制剂高产菌株的选育 菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。优良菌种不仅可以提高酶制剂产量和发酵原料的利用率，而且还与增加品种，缩短生产周期，改进发酵和提炼工艺条件等密切相关。优良菌种获得的三种途径： （1）从自然界分离筛选。 （2）用物理或化学的方法处理，诱变。 （3）用基因重组与细胞融合技术。 三、微生物酶制剂生产的发酵技术 （一）培养基 1.碳源 （甘薯、玉米、麸皮、米糠） 2.氮源 （豆饼、花生饼、菜籽饼、硫酸铵、尿素） 3.无机盐 4.生长因子和产酶促进剂 （二）培养方法 1.固体培养法 固体培养法也称麸曲培养法，该法是利用麸皮或米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼等，加水拌成含水适度的半固态物料作为培养基。 2.液体培养法 液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和产酶。根据通气方法的不同，又分为液体表面培养和液体深层培养。深层通气培养是目前应用最广的方法。 3.影响酶产生的一些因素 除培养基，发酵工艺参数对产酶的影响也十分明显。 （1）温度 （2）pH （3）通气 （4）搅拌 （5）泡沫 发酵过程中，由于发酵液受到强烈的通气搅拌，培养基中某些成分的变化及代谢中产生气体，会形成较多的泡沫，而且气泡不易消失，是由于培养基中蛋白质分子排在气泡表面形成一层吸附膜，聚集成泡沫层之故。 消泡剂：天然油类，醇类，脂肪酸类，胺类，酰胺类，磷酸酯类，金属皂类，聚硅氧烷等。 （6）添加诱导剂和抑制剂 诱导酶 抑制剂（表面活性剂） 第二节 酶类药物的提取和纯化 一、生物材料的预处理 （一）动物材料的预处理 1.机械处理 2.反复冻融 3.丙酮粉 组织经过丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使得蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中。 （二）微生物的预处理 要是胞外酶，则除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需要将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬浮液后再行提取。 1.干燥法 （1）空气干燥 （2）真空干燥 （3）冷冻干燥 2.机械法 （1）研磨法 （2）组织匀浆法 （3）超声波法 （4）高压匀浆法 3.酶法处理 二、酶的提取 1.水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取。经过预处理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒以及丙酮粉等，都可以用水溶液抽提。 许多酶再蒸馏水中不溶解，而在低盐浓度下易溶解，所以提取时加入少量盐可提高酶的溶解度。 2.有机溶剂法 某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，用水很难提取，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。丁醇具有以下特点： （1）亲脂性强，特别是亲磷脂的能力； （2)兼具亲水性，在0℃在水中的溶解度为10.5%；（3）在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。 3.表面活性剂法 三、酶制剂的工业提取法 (一)发酵液的预处理及过滤 絮凝剂 （二）酶液的脱色 0.1~1.5%活性炭 （三）盐析法 （四）有机溶剂法 （五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂 四、酶的纯化 酶比活，总活力回收 （一）杂质的除去 酶提取液中，除所需酶外，还含有大量杂蛋白，多糖，脂类和核酸等，需要除去。 （1）pH和加热沉淀法 利用蛋白质酸碱变性性质的差异可以通过调pH和等电点除去某些杂蛋白，也可以利用不同蛋白质对热稳定性的差异。（SOD酶） （2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的差别，也可以除去杂蛋白。 制备过氧化氢酶，加入氯仿除杂蛋白。 （3）选择性变性法 利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。 （4）核酸沉淀剂法 在微生物制备酶时，常含有较多核酸，可用核酸酶降解，离心分离，用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵，硫酸链霉素等。 （5）将酶与底物结合，用加热法除去杂蛋白。近来发现，酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，稳定性大大提高，这样可以用加热法除去杂蛋白。 （二）脱盐和浓缩 1.脱盐 （1）透析 玻璃纸袋 （2）凝胶过滤 Sephadex G－10 2..浓缩 （1）冷冻干燥法 （2）离子交换法 （3）超滤法 （4）凝胶吸水 （三）酶的结晶 把酶提纯到一定纯度以后，可使其结晶。 蛋白质分子多数处于含水的环境中，蛋白质分子与水分子结晶形成稳定的水合物。当蛋白质的浓度非常高的时候，溶液中没有足够可以与蛋白质结合的水分子用于形成水合物，在蛋白质分子