JIP3介导TrkB受体顺轴突转运和增强BDNF引发的信号通路激活的功能研究.docVIP

JIP 3介导TrkB受体顺轴突转运及增强BDNF引发的信号通路激活的功能研究--《山东大学》2011年博士论文 研究背景 神经元作为一种高度极化的细胞,通常由胞体、一条轴突和若干条树突组成,通过这些轴突和树突来与周围细胞发生联系；因此各种蛋白分子在神经元突起中的精确定位对于神经元的功能是非常重要的。目前已知,蛋白分子在神经元轴突和树突中的长距离顺向转运(由胞体向远端)主要是由沿着微管运行的分子马达kinesin介导的。其中,在神经元中起到多种功能的运载体的亚型是传统型kinesin (kinesin-1),它是由两条重链(kinesin heavy chain, KHC)和两条轻链(kinesin light chain, KLC)组成。目前发现的能够与kinesin-1结合的许多种可溶性的衔接蛋白通过与kinesin-1结合从而介导一些膜结合运载物来通过kinesin-1沿着微管运动。但是,目前尚不清楚在神经元当中哪些运载蛋白是通过kinesin-1来转运的。 神经营养因子(Neurotrophins, NTS)是一类对神经元的发育、存活和凋亡起重要作用的蛋白质,其成员包括神经生长因子(NGF),脑源性生长因子(BDNF),神经营养因子3(NT-3),神经营养因子4(NT-4)等,在神经元的存活、分化、神经突起的形成以及调节神经环路的功能中起到重要的作用。尤其是脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor, BDNF)在活性依赖的突触功能的变化中起到极为关键的作用。靶组织中分泌的BDNF与位于神经元轴突末梢的TrkB受体结合后可激活受体进行逆向信号转导。因此,神经元中的TrkB受体在细胞体内正确的合成、转运以及定位对于BDNF信号传导至关重要。TrkB受体在神经细胞里沿着轴突和树突顺向转运(从胞体向神经细胞末梢方向)需要由kinesin-1来介导。但是,TrkB受体在神经元轴突和树突中转运机制是否相同目前还尚不清楚。目前已有报道,TrkB受体在神经元中是由Rab27B/Slp1/CRMP-2这个衔接复合体介导与kinesin-1结合从而进行顺向转运的。但是,该实验数据显示,敲除掉这个衔接复合体中的任何蛋白只能使到达轴突末梢的TrkB受体减少30-50%,说明TrkB受体在神经元中的顺向转运还存在有其他的机制。 JNK相互作用蛋白3 (JNK-interacting protein 3; JIP3)在脑组织中广泛表达,在神经元当中分布于树突、核周体以及神经元轴突。JIP3最初作为一种JNK相互作用蛋白被发现,并且以支架蛋白的方式引发特异的氨基末端激酶信号分子。后续的基因学研究表明,JNK相互作用蛋白3(JIP3)是果蝇Sunday driver以及线虫UNC-16的一种同源体。上述两种都是在依赖kinesin的顺轴突转运中作为衔接蛋白的,作为它们的同源体,JIP3是否也能作为衔接蛋白介导某种蛋白与kinesin结合进行顺轴突转运呢?已有文献报道,JNK3能够与JIP3结合从而沿着轴突进行顺轴突转运,而JIP3能否和其他的运载物直接结合并且介导它们的顺向转运还不清楚。 研究目的 1.研究TrkB受体顺轴突转运的机制,是否有特异的衔接蛋白介导 2. TrkB受体在神经元轴突和树突中顺向转运的机制是否相同 3.通过对转运机制的调控是否能影响到BDNF引起的后续信号通路,甚至对神经元生理功能产生影响 研究方法 1.经典坐骨神经结扎实验 坐骨神经结扎实验是一种很成熟的能够从生化水平和免疫组化水平鉴定轴突内转运的分子的体内试验方法,因为坐骨神经组织中富含有长轴突和一部分施旺细胞,对于研究体内的轴突物质转运是很好的方法。成年雄性大鼠麻醉后,将其一侧坐骨神经用5-0线结扎,一天后,取结扎口附近的坐骨神经提取蛋白进行western blot试验检测其中的蛋白的水平,并取对照的未结扎的坐骨神经组织提取蛋白作为对照组,比较其蛋白水平差异,从而进行蛋白转运趋势分析。亦可将结扎口附近组织取材纵向冰冻切片,然后进行免疫组织化学实验分析其中的蛋白转运趋势。 2.免疫荧光分析方法 海马神经元体外培养第5天,用4%多聚甲醛固定10分钟,PBS洗3次后0.4% Triton透化10分钟,再次PBS洗后用10%山羊血清封闭一小时,然后加一抗4摄氏度孵育过夜,PBS洗3次后加荧光二抗,最后PBS洗后加防荧光粹灭剂封片,共聚焦显微镜下观察蛋白的定位情况,并用MetaMorph软件进行荧光定量分析。 3.免疫共沉淀实验分析蛋白蛋白相互作用 HEK293细胞电转染质粒后48小时,用加有合适浓度的蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液充分裂解细胞,裂解液在4摄氏度条件下以14000转/分钟的速度离心15分钟,在可溶性的上清