色谱学 lecture 7.ppt

高效液相色谱法 H P H P H P 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm·min-1.例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分. 高效液相色谱法特点： 1.高压：一般：150～300kg/cm2 甚至：500kg/cm2 2.高速：两相间交换：千分之几秒 分析时间较经典法少很多(几分~几十分钟) 3 高效：气相：2000塔板/米 液相：5000塔板/米 4.高灵敏度：紫外检测器：10－9g数量级 荧光检测器：10－11g(百万分之几） 试样量小（几微升） 5.高选择性：可分析在性质上极为相似化合物 （手性化合物、同位素、同分异构、空间异构） 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 仪器装置 液相色谱仪可分为四大系统： 泵系统 进样系统 分离系统 检测系统 泵系统 泵系统发展趋势 ①高效：填料颗粒↓→分离效率↑→ 柱压降↑→泵的工作压力↑ ②分析时间短：更快流速→柱压降↑ ③减少洗脱液用量 ④液相色谱的多元洗脱系统 进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 光电二极管阵列检测器 NORMAL PHASE 1980 2004 30% 5% Silica Gel 47% 44% Silica based bonded phases Diol Amino Cyano 3% 1% Alumina 20% 50% Chiral Bonded Phases 反相色谱reversed phase chromatography, RPC 固定相：非极性的反相介质，即为疏水性介质(R1,R2多为甲基，R为C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制备的试剂最多，统称为ODS – Octadecyl silica)。 烷基化密度：45%，55%的羟基用 三甲基氯硅烷覆盖，使表面完全 非极性化。 溶质在介质上的分配系数处决于溶质的疏水性，疏水性大，m高。 流动相：极性有机溶剂的水溶液(甲醇,乙晴, 异丙醇、正丙醇和四氢呋喃 等) 洗脱：[有机溶剂]增加。 反相HPLC-固相载体化学键合相 C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3 反相色谱的保留机理 ①疏溶剂理论 ②双保留机理 分离对象： ①同系物：烷烃数↑→tR↑ 直链tR＞支链tR ②化合物极性↑→ tR↓ 固定相对组分保留的影响： ①碳链长度：碳链↑→ tR↑ ②烷基覆盖量：覆盖量↑→ tR↑ 反相色谱中流动相选择 水＋有机改善剂 常用：甲醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环 极性：有机改善剂＜水 洗脱能力：有机改善剂＞水 极性顺序：甲醇＞乙腈＞二氧六环＞四氢呋喃 洗脱顺序：水＜甲醇＜乙腈＜二氧六环＜四氢 呋喃 反相键合相色谱的优点 ①流动相可选用水溶性 ⅰ.样品的溶解度范围提高 ⅱ.流动相可变性大 ⅲ.柱重现性好 ②固定相表面化学能低 ⅰ.平衡容易 ⅱ.梯度洗脱 ③