植物草乌蛋白的分离纯化与组分分析.pdfVIP

LC，014 植物草乌蛋白的分离纯化和组分分析 唐根源张椿嵋吴红京 (中国科学院福建物质结构研究所福州 350002) 1 前言 核糖失活蛋白(列bosome．inactivalingpm“ns，RJPs)是一种抑制蛋白质合成的蛋白毒 素…，迄今为止人们已从50多种植物的种子、根、叶或汁液中发现了60多种具有RJPs 的活性蛋白或蛋白粗提物。1。植物草乌每一部分都有毒，特别是根，误食后会产生呕吐、 瘫痪、麻痹、呼吸圉难等症状例。本文首次从植物草鸟中分离得到一种毒蛋白Aco。 2实验部分 2．1植物草乌(cao¨)毒蛋白的提取 提取过程在4℃下进行。1009草乌的根经切片粉碎后浸泡在700mL的5mmol／L磷酸 7．2)中，搅碎匀浆，静止过夜。经 盐缓冲溶液(PBs)(内含质量浓度为99，L的Nacl，pH 高速离心分离，上清液中逐步加入硫酸铵溶液，使溶液质量浓度达)009，L，充分搅拌． 静置数小时后过滤，沉淀溶解在少量的水中。首先对蒸馏水透析，再对5mmol／L的 F∞t PBs(PH6．5)透析，透析后的溶液上cM-s印haroseFlow(cM．sFF)层析柱，用如下条 的Nacl)，洗脱馏分在蛋白监控仪280nrn波长监控(图1)，收集第l峰，经浓缩．透析， 离心，上清液为草乌毒蛋白粗提液．暂命名为Aconin租蛋白。 200 250 Fraction Elutionvolume(mL) numbar 图1草乌的cM—sFF柱层析 图2^conj n的sephacryIs一200凝胶柱层析 22粗蛋白Aconjn的纯度鉴定 Aconin粗蛋白的溶液经0．45 S．200凝胶过滤柱(图2) um过滤，上清液上Sephacryl 和高效蛋白柱分离(图3)，并利用光电二极管阵列检测器的光谱特性进行粗蛋白Aconin 峰的纯度鉴定。从图3看出，在第2峰后有一小峰，根据相应紫外光谱图(图4)，第3峰 的最大吸收峰不在波长280nm处，而第1，2峰在波长280衄处有最大吸收，在波长260nm 处有最小吸收，因而峰1，2为所需蛋白峰，峰3不是所需蛋白峰，且峰1，2的峰前、峰 顶、峰后3点的光谱图完全重叠，可说明峰1．2为单一物质。根据凝胶色谱峰1，2的保 留时间，峰2为我们所需蛋白峰。 23 Aconin毒蛋自的制备 在scpliacryls一200柱上难于得到Aconin蛋白的纯品。我们在两根串联蛋白柱(Protein ．50． 125)上，用提高样品的浓度和加大进样量的办法制备Aconjn毒蛋白。收集图3中的阴影 部分，每次可收集吸光度为34的溶液1mL左右。收集液经反相高效液相色谱和高效凝 胶蛋白柱分离均得一个峰，且峰前、峰项和峰后3点光谱图完全相同，光谱图与图2中的 第2峰～致。收集液经处理后在电泳上早一条带，可初步确证收集溶液为单一组分。收集 液经冷冻干燥得干粉，暂命名为Aco。 24 Aco分子质量测定 1 以牛血清蛋白(67 000)、卵清蛋白(43 000)、天花粉蛋白(27000)、溶茁酶(14 000)为 标准蛋白，用图2中的分离条件得到分子质量与洗脱体积的校正曲线。在相同条件下测出 AcO的保留体积后，根据分子质量校正曲线算出 500。 Aco毒蛋白